SNARE及其相關蛋白與生育能力相關性的探討

(天津愛維醫(yī)院生殖中心，天津 300171)

可溶性NSF附著蛋白受體(Soluble NSF Attachment Protein Receptor，SNARE)蛋白通過介導囊泡的膜融合來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的物質運輸和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質的釋放。此外，多項研究表明SNARE及其相關蛋白與卵泡發(fā)育排卵、卵母細胞的減數(shù)分裂、受精和男性生殖器的發(fā)育存在一定的關聯(lián)。

一些大分子物質或是不能穿透細胞膜或是細胞器膜的顆粒性物質，需要借助囊泡轉運(Vesicle trafficking)的方式來實現(xiàn)物質進出細胞的轉運以及物質在細胞內(nèi)各個細胞器之間的轉運。在囊泡轉運過程物質被膜包裹形成囊泡、囊泡與質膜融合后將物質釋放到細胞外或目標細胞器腔內(nèi)。如胰島素在胰島β細胞內(nèi)高爾基體上合成分泌后,它被包裹形成囊泡，囊泡與細胞膜融合后將胰島素分泌到細胞外(血液中)[1]。而在囊泡膜融合過程中可溶性NSF附著蛋白受體(Soluble NSF Attachment Protein Receptor，SNARE)及其相關蛋白起著重要作用。

1 SNARE及其相關蛋白的概述

1.1SNARE蛋白的構成：可溶性NSF附著蛋白受體(Soluble NSF Attachment Protein Receptor，SNARE)蛋白因為作為N-乙基馬來酰胺-敏感因子(N-ethyl-maleimide-sensitive factor,NSF)和可溶性NSF附著蛋白(soluble NSF attachment proteins,SNAP)的膜受體而被命名。SNARE蛋白是一個龐大的蛋白超家族，在哺乳動物的細胞上其擁有60個成員[2]。Synaptobrevin/VAMP,syntaxin及SNAP-25以1：1：1的比例聚合成穩(wěn)定的三聚體結構,即SNAREs核心復合體。其中Synaptobrevin/VAMP為位于囊泡膜上的SNARE蛋白(vesicle membrane SNAREs，v-SNAREs)，syntaxin及SNAP-25則是?？吭诎屑毎せ蚴前屑毎髂ど系腟NARE蛋白(target membrane SNAREs，t-SNAREs)。v-SNAREs與t-SNAREs結合形成SNARE核心復合體，從而啟動了囊泡膜融合過程[3]。

1.2SNARE主要相關蛋白及功能：現(xiàn)筆者簡要介紹與膜融合過程關系密切的三類SNARE相關蛋白。Munc-18蛋白在脊椎動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，有研究表明Munc-18 與syntaxin 結合可調(diào)節(jié)SNARE 核心復合體的形成。在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，Munc-18在二型糖尿病大鼠胰島內(nèi)的過量表達可以促進Munc18b/Syntaxin-3/VAMP8/SNAP-25復合體的組裝，從而促進膜融合增強胰島素的釋放，改善由于對葡萄糖刺激不敏感所導致的胰島素分泌不足[4]。但也有其他研究表明Munc-18與syntaxin 結合會抑制后者與SNAP-25或是Synaptobrevin的結合從而阻礙SNARE 核心復合體的形成[5]。

在膜融合囊泡內(nèi)物質釋放之后,NSF和α-SNAP蛋白協(xié)助SNARE 核心復合體解聚，從而實現(xiàn)SNARE蛋白的循環(huán)再利用。其中NSF具有ATP水解酶活性，它與SNARE 核心復合體結合后為SNARE 核心復合體的解聚提供能量。而NSF與SNARE的結合必須借助α-SNAP才能實現(xiàn)[6]。

2 SNARE及其相關蛋白對生育能力的影響

2.1對卵泡發(fā)育及排卵的影響：α-SNAP協(xié)助NSP實現(xiàn)SNARE 核心復合體解聚和循環(huán)再利用，因此α-SNAP對維持SNARE蛋白的功能以保證囊泡膜融合能持續(xù)進行起到重要作用。有研究者檢測出生天數(shù)不同的小鼠卵巢中α-SNAP的表達量，結果顯示α-SNAP的表達量在出生后30 d小鼠卵巢中開始明顯升高，并且在出生后60 d小鼠卵巢中其表達量上升至頂峰。考慮在出生后30 d或60 d的小鼠的卵巢內(nèi)處于發(fā)育階段的竇卵泡數(shù)目大量增加，因此可以推測α-SNAP的表達量與發(fā)育的竇卵泡和成熟卵泡有關。此外，研究者對比了α-SNAP基因突變小鼠和正常野生小鼠的各項結果，發(fā)現(xiàn)在給予這兩種小鼠PMSG/HCG刺激后，這兩種小鼠卵巢內(nèi)的α-SNAP的表達量均較刺激前有所增加，α-SNAP基因突變小鼠卵巢中α-SNAP的表達量要明顯低于正常野生小鼠，并且α-SNAP基因突變小鼠卵巢中竇卵泡占總卵泡的比例也低于正常野生小鼠。在給予PMSG/HCG刺激后，α-SNAP基因突變小鼠卵巢中排卵后的黃體數(shù)目明顯低于正常野生小鼠，而且取卵所得到的MII期成熟卵子的數(shù)目也少于正常野生小鼠[7]。以上的研究結果提示了α-SNAP與卵泡發(fā)育、成熟及排卵有關。

SNAP-25、Synaptobrevin和syntaxin 是構成SNARE核心復合體的蛋白，它們的表達量直接影響SNARE核心復合體介導的膜融合。有研究顯示在注射了孕馬血清促性腺激素(PMSG)后，在FSH的刺激下小鼠卵巢內(nèi)SNAP-25和synaptotagmin VII的表達量明顯增加，并且將FSH受體的 siRNA導入竇前卵泡的顆粒細胞后解除了FSH刺激所導致的SNAP-25和synaptotagmin VII的表達量的增加。表明SNAP-25和synaptotagmin VII的表達受FSH及FSH受體的調(diào)節(jié)[8]。同時其他文獻報道在注射HCG后8 h，大鼠卵巢顆粒細胞中SNAP-25的表達量明顯增加，并且孕酮受體(Progesterone receptor，PGR)基因表達小鼠(排卵障礙小鼠模型)在注射HCG后8 h其卵巢顆粒細胞上SNAP-25的表達的增加量要明顯低于正常野生小鼠，這表明SNAP-25的表達量受LH調(diào)節(jié)[9]。但也有文獻報道調(diào)節(jié)SNAP-25在顆粒細胞上表達量的是FSH而不是LH[10]。有研究者發(fā)現(xiàn)雌激素(E2)和睪酮(T)降低了人呼吸道平滑肌細胞(airway smooth muscle cells，ASMCS) 上SNAP-25的表達[11]。此外，有研究表明伴有胰島素抵抗的多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜上Munc18c的表達量高于正常子宮內(nèi)膜，而其Syntaxin-4的表達量低于正常子宮內(nèi)膜。同時體外實驗添加胰島素和睪酮顯著降低了人子宮內(nèi)膜間質細胞上Munc18c的表達，但未影響其Syntaxin-4的表達量[12]。

綜上所述，可以推斷SNARE及其相關蛋白與卵泡發(fā)育、成熟及排卵有關。關于SNARE及其相關蛋白調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的作用機制尚未明確。但是之前有研究指出顆粒細胞或卵母細胞是以胞吐的形式分泌抗苗勒管激素(AMH)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)及生長分化因子9(GDF9)[13]等卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)因子。因此筆者推測SNARE及其相關蛋白通過影響囊泡的膜融合過程來影響這些卵泡生長調(diào)節(jié)因子的胞吐式分泌釋放，從而調(diào)節(jié)卵泡生長過程。同時筆者還猜測SNARE及其相關蛋白不僅影響這些卵泡生長調(diào)節(jié)因子從顆粒細胞或是卵母細胞上的胞吐式分泌，還有可能影響這些調(diào)節(jié)因子作用于下丘腦、垂體及卵巢細胞時的膜融合胞吞過程，從而影響它們對下丘腦、垂體及卵巢的反饋調(diào)節(jié)作用。當然，這些猜想和推斷需要進一步的研究來驗證。

2.2對卵母細胞的減數(shù)分裂的影響：由于持續(xù)高水平的環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)在維持減數(shù)分裂抑制中起到重要作用，而持續(xù)性活化的G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptor，GPCR)對于維持高水平的cAMP起重要作用，同時活化的GPCR是通過參與囊泡膜融合的過程實現(xiàn)信號轉導。因此有研究者通過誘導SNAP-25基因突變的蟾蜍卵母細胞來探討囊泡膜融合與減數(shù)分裂抑制之間的關系。結果表明阻斷囊泡膜融合導致了絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cyclin 25 homolog C，Cdc25C)信號的驟減，從而激活了促成熟因子 (maturation promoting factor，MPF)，誘發(fā)生殖泡裂解、促使卵母細胞成熟并停留于第二次減數(shù)分裂中期(MII期)。也就是說SNAP-25基因的突變、囊泡膜融合的障礙會破壞減數(shù)分裂的抑制而誘發(fā)卵母細胞的減數(shù)分裂再啟動和成熟化[14]。此外，有研究表明syntaxin 4表達于第二次減數(shù)分裂中期(MII期)的卵母細胞上[15]。

2.3對受精過程和男性生殖器發(fā)育的影響：頂體為覆蓋成熟精子頭部表面2/3的囊泡結構，在頂體內(nèi)部存在大量的頂體酶。精子頭部與成熟卵子的透明帶接觸后誘發(fā)頂體反應，導致頂體內(nèi)的頂體酶以泡吐的方式釋放出來。普遍認為頂體反應與SNARE蛋白介導的膜融合過程有關聯(lián)。當精子頭部與透明帶接觸后，隨著Ca2+的內(nèi)流，精子頭部質膜形態(tài)發(fā)生改變以暴露頂體外膜，然后頂體外膜與卵子質膜在SNARE蛋白介導下發(fā)生膜融合，膜融合之后，在頂體外膜上出現(xiàn)許多小孔，頂體酶經(jīng)這些小孔釋放出來消化局部的透明帶，同時頂體帽逐漸從精子頭部脫落下來，之后穿過透明帶的精子頭部與卵子質膜上的受體結合從而啟動精子頭部質膜與卵子質膜的融合[16]。有研究發(fā)現(xiàn)在精子的中段、尾部和精子頭部的細胞內(nèi)部構造中不存在syntaxin1和syntaxin2，但是在精子頭部的頂體表面有syntaxin的存在，但是在精子頭部的赤道板和頂體后區(qū)域上沒有syntaxin的存在，同時VAMP1和VAMP2也存在著類似的分布[17]。此外，有研究表明α-SNAP缺陷的雄性小鼠的精子存在頂體反應障礙阻礙受精[18]。由此證實SNARE蛋白與受精過程中的頂體反應存在著一定的關聯(lián)。

為了研究SNARE蛋白對男性生育能力的影響，研究者將含有人類VAMP7基因的染色體顯微注射入小鼠的受精卵內(nèi)，以得到表達人類VAMP7基因的雄性小鼠模型。結果表明VAMP7基因表達的增加會導致雄性小鼠雙側睪丸下降障礙導致隱睪，同時還可以導致雄鼠外生殖器的畸形。并且經(jīng)實驗證實這是由于VAMP7增強了雌激素受體在雄鼠泌尿生殖系統(tǒng)的效應，因此導致生殖器男性化發(fā)育障礙，造成先天性泌尿生殖系統(tǒng)缺陷[19]。

3 結語

SNARE及其相關蛋白通過介導囊泡融合過程從而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質的釋放和細胞內(nèi)的物質轉運。已經(jīng)有研究表明SNARE及其相關蛋白與兒童多動癥[20]及對葡萄糖刺激不敏感所致的胰島素分泌障礙型二型糖尿病有關聯(lián)[4，21]。同時，對SNARE及其相關蛋白與女性和男性生育能力相關性的研究表明，女性的卵泡發(fā)育、成熟及排卵，還有男性精子和生殖器的功能均與SNARE及其相關蛋白有著密切的關聯(lián)。因此，進一步闡明SNARE及其相關蛋白對生育能力調(diào)節(jié)的具體作用機制，對實現(xiàn)通過調(diào)節(jié)SNARE及其相關蛋白的效應來改善各種生育障礙性疾病具有重要意義。