食源性微生物的檢測方法

◎ 張雪穎

（蘇州大學(xué) 劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇 蘇州 215123）

食品安全是公眾最為關(guān)注的焦點(diǎn)之一。食源性病原菌，如單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌屬和空腸彎曲桿菌等廣泛存在并與疾病爆發(fā)密切相關(guān)。盡管食品加工技術(shù)的改進(jìn)和嚴(yán)格的工業(yè)衛(wèi)生環(huán)境限制了微生物的致病性，但食源性疾病的爆發(fā)仍在繼續(xù)。由微生物和生物化學(xué)活性引起的食物腐敗對食品工業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，有效地檢測原料、食品加工環(huán)境和最終產(chǎn)品中引起疾病和腐敗的微生物對于預(yù)防食源性疾病的大規(guī)模流行和資源的損失至關(guān)重要。

1 常規(guī)檢測方法

食品行業(yè)采用常規(guī)微生物檢測方法，觀察人工培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長。通常需要預(yù)富集步驟以成功地從復(fù)雜食物系統(tǒng)中分離目標(biāo)微生物。預(yù)富集之后，將樣品鋪板在固體培養(yǎng)基上，再選擇的溫度和氣氛下孵育。最后，根據(jù)各種生化和/或免疫學(xué)特征鑒定分離物。許多生長培養(yǎng)基可用于選擇性檢測食源性病原體和腐敗生物。整個過程需要5～7天。

常規(guī)方法費(fèi)時費(fèi)力，這為許多工業(yè)應(yīng)用帶來了不便，特別是在今天的全球分銷市場上。食品中的微生物可進(jìn)入休眠狀態(tài)或損傷狀態(tài)，并在檢測培養(yǎng)基上變得不可培養(yǎng)；這將導(dǎo)致低估污染水平，或未能將病原體與污染樣品隔離。開發(fā)恢復(fù)方法以復(fù)蘇損傷的食源性微生物，對于準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析具有重要意義。一些恢復(fù)步驟利用修復(fù)試劑來恢復(fù)細(xì)胞損傷，然而除了額外的時間消耗，受傷的細(xì)胞可能無法充分恢復(fù)，從而需要新的方法來檢測非受傷和受傷的生物體以防止假陰性結(jié)果。

2 生化鑒定方法

快速準(zhǔn)確地鑒定從食物樣品中分離的病原體對于質(zhì)量保證和食品安全問題源頭的快速識別具有重要意義。微生物的生化自動識別系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于食品微生物實(shí)驗(yàn)室。自動化系統(tǒng)減少了鑒定分析的時間，增加了被分析樣品的數(shù)量，提高了各種分析的準(zhǔn)確性。因此，自動化已經(jīng)用于許多流行病的診斷，其現(xiàn)正與微型生化試劑盒一起使用。此類試劑盒用于鑒定常見的食源性病原體，如腸道細(xì)菌、彎曲菌、李斯特菌、沙門氏菌等。微型裝置由一次性裝置組成，該裝置含有15～30個培養(yǎng)基或特異性滴定的底物以鑒定特定的細(xì)菌群或物種。儀器的進(jìn)步使得套件的自動化系統(tǒng)成為可能，這些自動化儀器孵育細(xì)菌，監(jiān)測生化變化，為任何富集群體生成表型譜，并通過比較配置文件與已知的配置文件來識別細(xì)菌。另一種分析細(xì)菌組成或代謝特性的自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，如脂肪酸譜或碳氧化譜，被用于病原體檢測。與傳統(tǒng)方法相比，這些系統(tǒng)具有一些重要優(yōu)勢，包括減少人工，減少人為錯誤，增加樣品通量及更快的周轉(zhuǎn)時間。

3 免疫鑒定法

抗原和抗體之間的高度特異性結(jié)合，特別是單克隆抗體，促進(jìn)了各種免疫學(xué)檢測的發(fā)展。免疫分析方法簡單，用途廣泛，是一組快速病原體檢測方法，可用于食品和環(huán)境的檢測。免疫學(xué)分析包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、顆粒凝集法（LA）、免疫沉淀法、免疫熒光顯微鏡和免疫傳感器法。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA是目前應(yīng)用于食品病原體檢測的最成熟的免疫學(xué)技術(shù)。ELISA被描述為“三明治”試驗(yàn)，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比，大多數(shù)ELISA檢測所需時間病毒為1 h，細(xì)胞小于36 h。沒有預(yù)富集時ELISA的靈敏度范圍只有103～105個細(xì)菌細(xì)胞，不足以檢測導(dǎo)致低水平污染的致病性細(xì)菌細(xì)胞。

3.2 顆粒凝集法（LA）

LA是最簡單的免疫分析方法，微孔中的抗體包被顆粒與來自血清或來自食物的純培養(yǎng)分離物樣品的稀釋液共同孵育。如果樣品中含有要篩選的標(biāo)記，就會檢測到顆粒的凝集。一種名為反向被動乳膠凝集（RPLA）的LA修飾物可以檢測可溶性抗原。RPLA主要用于檢測食品提取物中的毒素或純培養(yǎng)物中的毒素。

3.3 免疫沉淀法

免疫共沉淀是基于“三明治”程序。樣品被直接裝入含有附加膠體金標(biāo)記抗體的室內(nèi)，當(dāng)樣品擴(kuò)散到固體基質(zhì)后，任何抗體識別都會導(dǎo)致可檢測的顏色變化。該方法快速、簡便。結(jié)果可以在10 min內(nèi)讀取，無需任何其他操作。然而，該程序需要一個漫長的預(yù)富集步驟。

3.4 免疫傳感器

免疫傳感器通過將反應(yīng)固定在被稱為換能器的固體表面上來檢測抗原-抗體結(jié)合。經(jīng)過特定的綁定后，傳感器將表面變化參數(shù)轉(zhuǎn)換為可檢測的電信號。許多研究已經(jīng)探討了應(yīng)用新型免疫傳感器技術(shù)檢測和計數(shù)食源性病原體的潛力。這種方法在幾個小時內(nèi)就會產(chǎn)生結(jié)果，類似于經(jīng)典ELISA。免疫傳感器是便攜式的，產(chǎn)生可讀的數(shù)字信號而無需人工操作。然而大多數(shù)免疫傳感器需要昂貴的設(shè)備和較長的前期準(zhǔn)備。

3.5 免疫磁分離（IMS）

免疫磁分離（IMS）是一種能增強(qiáng)免疫分析和改善上述問題的替代方法。IMS對磁性珠的特異性抗體進(jìn)行配對，并有效地從食物基質(zhì)中捕獲目標(biāo)細(xì)菌細(xì)胞。大多數(shù)情況下，IMS與其他檢測方法相結(jié)合，如ELISA、磁力顯微鏡、PCR或平板計數(shù)等，以提高檢測靈敏度。例如在ELISA分析中，IMS的預(yù)選擇步驟可以使檢測靈敏度提高近100倍。

4 生物傳感器

在微生物檢測領(lǐng)域，生物傳感器是能夠?qū)⑸锓磻?yīng)轉(zhuǎn)化為可觀測信號的分析工具。生物傳感器一般由生物識別元件和換能器兩部分組成。生物識別元件體由固定的生物化合物組成，可識別目標(biāo)分析物。傳感器將識別樣品轉(zhuǎn)換為可測量的電信號、光信號或熱信號。有時，一個額外的放大器響應(yīng)來自傳感器的小信號，并為信號處理器提供更大的輸出信號。用于病原體檢測的生物傳感器根據(jù)其使用的生物受體可分為三類，分別是細(xì)胞代謝模式、抗體或抗原標(biāo)志及核酸分析。

抗體傳感器是微生物診斷中最流行的生物傳感器，其原理依賴于上述抗原和抗體之間高度特異性的三維圖像匹配。兩種類型的基于免疫學(xué)的生物傳感器，第一種采用固定在電極上的捕獲抗體，來捕獲目標(biāo)抗原。通過氧化還原分子或酶標(biāo)記的二抗體來實(shí)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。第二種利用固定在電極上的抗原來檢測特定的抗體。

酶標(biāo)記免疫分析方法因其高靈敏度和直接可視化等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的重視。事實(shí)上，便攜式生物傳感器基于ELISA原理，但更小，更快，更易解釋和更方便。

生物分析傳感器的最新進(jìn)展利用了某些酶發(fā)射光子、生物發(fā)光，并伴隨生化反應(yīng)。三磷酸腺苷（ATP）-生物發(fā)光廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，以快速計算加工環(huán)境中總細(xì)菌的存在并檢測飲用水或飲料中的病原體。該技術(shù)基于ATP的存在來測量光強(qiáng)度，一種通過水解ATP來產(chǎn)生光的熒光素酶。光的強(qiáng)度一般與污染程度平行。不僅僅是活細(xì)菌，ATP是任何生物物質(zhì)的基本化合物，因此ATP-生物發(fā)光被用作所有生物污染的快速指示器，但不是特異性的，且靈敏度有限。

最近研發(fā)的檢測工具是利用核酸雜交的診斷生物傳感器。經(jīng)典的光學(xué)檢測方法使用標(biāo)記有熒光基團(tuán)的特性探針。較新的方法是引入用電活性化學(xué)物質(zhì)標(biāo)記的DNA鏈作為信號分子而不是熒光基團(tuán)。DNA生物傳感器具有高度靈敏、快速、廉價、穩(wěn)定、環(huán)境不敏感，并且與微陣列技術(shù)兼容的特點(diǎn)。

作為病原體檢測的新技術(shù)，生物傳感器顯示出現(xiàn)場實(shí)時檢測的巨大潛力；然而，需要更好地描述生物傳感器是如何受到食品基質(zhì)和低細(xì)菌數(shù)量的影響，以及如何區(qū)分死和活細(xì)胞。在使用實(shí)用工具進(jìn)行原位分析之前，進(jìn)一步的研究和開發(fā)對于發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力指標(biāo)和提高生物傳感器的特異性和敏感性至關(guān)重要。