超聲波-離子液體輔助麥谷蛋白酶解工藝的優(yōu)化及產(chǎn)物抗氧化活性研究

張雪紛,吳瓊英,2*,賈俊強(qiáng),匡 聰

(1.江蘇科技大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院, 鎮(zhèn)江 212018) (2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所, 鎮(zhèn)江 212018) (3.江蘇科技大學(xué) 糧食學(xué)院，鎮(zhèn)江 212004)

酶解法是提高蛋白功能特性的重要途徑之一,也是獲得生物活性肽的主要方式．研究表明,酶解前的預(yù)處理能改善蛋白酶解的效果[1-2],文獻(xiàn)[3]通過微射流均質(zhì)預(yù)處理大豆蛋白,發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的酶解效率及酶解產(chǎn)物乳化性能均得到了提高．近年來,由于超聲處理具有操作簡單、成本低和安全高效等優(yōu)點,已被用于酶解反應(yīng)中,如文獻(xiàn)[4]采用超聲預(yù)處理玉米蛋白提高了酶解效率和酶解產(chǎn)物抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)的活性．離子液體具有良好的溶解性、不揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性,對蛋白作用后,會使蛋白分子發(fā)生再生或伸展,可暴露出更多的蛋白活性基團(tuán)[5]．利用超聲協(xié)同離子液體處理以促進(jìn)大分子物質(zhì)酶解的技術(shù)已被應(yīng)用,如可促進(jìn)稻草中纖維素的酶解[6]和蟲草素酶解[7],而在蛋白質(zhì)酶解中應(yīng)用較少．課題組前期研究發(fā)現(xiàn),超聲-離子液體處理技術(shù)可提高蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性,同時酶解產(chǎn)物中低分子量肽含量也明顯增多[8]．本研究以麥谷蛋白為原料,研究超聲-離子液體處理對麥谷蛋白水解度及酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響,為超聲-離子液體處理技術(shù)在蛋白酶解中的應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)．

1 試驗

1.1 材料與試劑

小麥谷朊粉購于徐州奧凱小麥淀粉有限公司;[BMIM]PF6購于上海御略化工有限公司;堿性蛋白酶向諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司提供;菲洛嗪購于Alfa Aesar公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)購于Sigma-Aldrich 公司;其余試劑均為化學(xué)分析純．

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器，金壇市白塔新寶儀器廠;CP153分析天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司;FDU-2100冷凍干燥機(jī)，日本東京理化器械;H-1600RW微型高速臺式冷凍離心機(jī)，上海利鑫堅離心機(jī)有限公司;PHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;UV-9600紫外可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司;HH·S21-6-S型電熱恒溫水浴鍋，上海精其儀器有限公司;Q700智能型超聲波破碎儀，美國Qsonica公司．

1.3 試驗方法

1.3.1 麥谷蛋白的制備

將谷朊粉加入到去離子水中配成100 g/L懸浮液,攪拌均勻后用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至12.0,靜置提取1 h,5 000 r/min離心20 min取上清液,上清液中加入無水乙醇使其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到65%,混勻后用1 mol/L HCl將pH調(diào)至7.0,靜置沉淀24 h后,5 000 r/min離心,收集沉淀,冷凍干燥得到麥谷蛋白[9]．

1.3.2 水解度(degree of hydrolysis,DH)的測定

采用pH-stat 法[10]測定水解度(DH),計算公式如下:

式中：c為NaOH濃度,mol/L;V為消耗NaOH的體積,mL;α為氨基的解離度;Mp為底物蛋白的質(zhì)量,g;htot為底物蛋白的肽鍵總數(shù)8.38 mmol/g．

1.3.3 超聲-離子液體輔助麥谷蛋白酶解的工藝優(yōu)化

(1) 超聲-離子液體預(yù)處理麥谷蛋白的方法

將麥谷蛋白用去離子水配制成懸浮液,然后加入適當(dāng)體積的離子液體([BMIM]PF6),進(jìn)行超聲處理,在5 000 r/min下離心10 min,溶液體系分為3層(上層為水相,中間層為蛋白,下層為離子液體),除掉水相,回收下層離子液體,麥谷蛋白層用去離子水反復(fù)洗滌、離心,以除去殘留離子液體,蛋白冷凍干燥后用于酶解試驗．

(2) 麥谷蛋白的酶解

以未處理麥谷蛋白為對照,研究超聲-離子液體預(yù)處理后麥谷蛋白水解度變化,酶解條件為:底物濃度20 g/L,酶解溫度55 ℃,酶解pH 8.0,酶解時間30 min,蛋白酶為alcalase,加酶量3 000 U/g．

(3) 超聲-離子液體預(yù)處理麥谷蛋白的單因素影響試驗

對超聲功率，超聲時間，水/離子液體體積比，料液質(zhì)量濃度進(jìn)行單因素試驗，考察各因素對預(yù)處理后麥谷蛋白水解度的影響。以水與離子液體混合液為超聲能傳播介質(zhì),在水/離子液體體積比1 ∶1、料液質(zhì)量濃度20 g/L和超聲時間6 min條件下,分別將超聲功率設(shè)定為100、200、300、400和500 W；在水/離子液體體積比1 ∶1、料液質(zhì)量濃度20 g/L和超聲功率300 W條件下,分別將超聲時間設(shè)定為3、6、9、12和15 min；在料液質(zhì)量濃度20 g/L、超聲功率300 W和超聲時間6 min條件下,分別將水/離子液體體積比設(shè)定為0.5 ∶1、1.0 ∶1、1.5 ∶1、2.0 ∶1和2.5 ∶1；在超聲功率300 W、超聲時間6 min和水/離子液體體積比1 ∶1條件下,分別將料液質(zhì)量濃度設(shè)定為10、20、30、40和50 g/L．

(4) 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素影響試驗基礎(chǔ)上,采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件進(jìn)行試驗設(shè)計．以水解度為響應(yīng)值,采用4因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化預(yù)處理工藝,響應(yīng)面因素水平設(shè)計如表1．

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

1.3.4 酶解產(chǎn)物抗氧化活性試驗

按照響應(yīng)面分析確定的最佳工藝條件預(yù)處理麥谷蛋白,然后利用alcalase進(jìn)行酶解,酶解條件如上文所述．酶解產(chǎn)物經(jīng)離心后凍干,進(jìn)行抗氧化活性分析,并以未預(yù)處理的麥谷蛋白酶解產(chǎn)物作為對照,比較超聲-離子液體預(yù)處理對麥谷蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響．

(1) 清除DPPH 自由基活性測定

將麥谷蛋白酶解產(chǎn)物配制成不同濃度(20、40、60、80、100 μg/mL),分別取2 mL麥谷蛋白酶解液和2 mL濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液混勻,在25℃靜置30 min,在517 nm處測吸光值[11]．按下式計算DPPH自由基清除率:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中：A0為DPPH和95%乙醇溶液混合后的吸光值,A1為DPPH和麥谷蛋白酶解液混合后的吸光值,A2為麥谷蛋白酶解液和95%乙醇溶液混合后的吸光值．

(2) Fe2+螯合能力測定

將麥谷蛋白酶解產(chǎn)物配制成不同濃度(10、20、30、40、50 μg/mL),分別取3 mL麥谷蛋白酶解液,依次加入0.05 mL 2 mmol/L FeCl2和0.1 mL 5 mmol/L菲洛嗪,混勻后在25℃反應(yīng)10 min,在562 nm處測其吸光值[12]．按下式計算Fe2+螯合率:

Fe2+螯合率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100

式中：A0為空白組的吸光值,A1為樣品組的吸光值,A2為去離子水代替FeCl2后的吸光值．

(3) 還原力測定

將麥谷蛋白酶解產(chǎn)物配制成不同濃度(20、40、60、80、100 μg/mL),分別取2 mL樣品溶液,加入2 mL質(zhì)量濃度為1%的鐵氰化鉀溶液,混勻后在50 ℃下反應(yīng)20 min,加入2 mL質(zhì)量濃度為10%三氯乙酸終止反應(yīng),5 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量濃度為0.1%三氯化鐵溶液,混勻后靜置10 min,在700 nm處測定吸光值,用吸光值大小表示還原力[13]．

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素影響試驗結(jié)果與分析

(1) 超聲功率對麥谷蛋白水解度的影響

麥谷蛋白水解度隨超聲功率的變化如圖1．由圖1可知,當(dāng)超聲波功率在100～300 W時,麥谷蛋白的水解度會隨著超聲功率的增加而顯著增加,在超聲功率300 W時達(dá)到最高值,之后逐漸降低．這可能是因為當(dāng)超聲功率在100～300 W時,隨著超聲功率的增加,麥谷蛋白的蛋白質(zhì)分子發(fā)生了伸展,暴露出更多堿性蛋白酶的作用位點,從而促進(jìn)了麥谷蛋白的水解[14],但當(dāng)超聲功率高于300 W時,超聲波的瞬時高溫高壓、瞬態(tài)空化等作用[15]又使伸展的蛋白分子產(chǎn)生了卷曲和折疊,暴露的酶解位點變少,不利于堿性蛋白酶酶解．因此,本研究選擇超聲功率為300 W．

圖1 超聲功率對麥谷蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of glutenin

(2) 超聲時間對麥谷蛋白水解度的影響

麥谷蛋白水解度隨超聲時間的變化如圖2．由圖2可以看出,當(dāng)超聲時間為6 min時,麥谷蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解的水解度最高,超聲時間大于或小于6 min,麥谷蛋白的水解度會降低．這可能是因為在相同的條件下,超聲處理時間過短,麥谷蛋白的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)尚未完全伸展,而處理時間太長,又破壞了酶的作用位點．因此,合適的超聲時間可促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解．本研究選擇超聲時間為6 min．

圖2 超聲時間對麥谷蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on hydrolysis of glutenin

(3) 水與離子液體的體積比值對麥谷蛋白水解度的影響

麥谷蛋白水解度隨水與離子液體體積比值的變化如圖3．蛋白質(zhì)在離子液體中易產(chǎn)生再生現(xiàn)象,蛋白質(zhì)分子發(fā)生伸展或卷曲,與超聲有相似的處理效果[8]．由圖3可以看出,水/離子液體體積比在0.5 ∶1～1.0 ∶1時,隨著水/離子液體比值的增加,麥谷蛋白水解度也相應(yīng)提高,在水/離子液體比值為1.0 ∶1時,麥谷蛋白的水解度達(dá)到最大值;當(dāng)水/離子液體比值進(jìn)一步增大時,麥谷蛋白水解度卻逐漸下降．這與離子液體具有較大的粘度有關(guān),若其體積分?jǐn)?shù)太大,會影響超聲能量的傳遞,而低體積分?jǐn)?shù)的離子液體又達(dá)不到改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的．因此本研究選擇水/離子液體比值為1.0 ∶1．

圖3 水/離子液體體積比對麥谷蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of ratio of water to ionic liquidon hydrolysis of glutenin

(4) 料液質(zhì)量濃度對麥谷蛋白水解度的影響

麥谷蛋白水解度隨料液質(zhì)量濃度的變化如圖4．由圖4可知,麥谷蛋白水解度隨著料液質(zhì)量濃度的增大而增大,在料液質(zhì)量濃度20 g/L時,麥谷蛋白水解度達(dá)到最大值;當(dāng)料液質(zhì)量濃度進(jìn)一步增大時,麥谷蛋白水解度開始逐漸降低．在用超聲處理料液時,低濃度的料液會導(dǎo)致超聲產(chǎn)生太強(qiáng)的作用力,使蛋白分子經(jīng)伸展后進(jìn)一步折疊,不利于酶解,而當(dāng)料液質(zhì)量濃度太高時,則會因溶液體系粘度太大而不利于超聲能量傳遞,弱化超聲處理作用,因此,合適的料液質(zhì)量濃度能夠提高超聲-離子液體的處理效果．本研究選擇料液質(zhì)量濃度為20 g/L．

圖4 料液質(zhì)量濃度對麥谷蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of material mass concentrationon hydrolysis of glutenin

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

(1) 回歸模型的建立與分析

用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件設(shè)計試驗,并采用Box-Behnken設(shè)計原理,以麥谷蛋白水解度為響應(yīng)值(Y),選擇超聲功率(A)、超聲時間(B)、水/離子液體體積比值(C)和料液質(zhì)量濃度(D)進(jìn)行4因素3水平的旋轉(zhuǎn)正交試驗設(shè)計．Box-Behnken設(shè)計方案共有29次試驗,試驗結(jié)果見表2．

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,建立麥谷蛋白水解度(Y)與超聲功率(A)、超聲時間(B)、水/離子液體比值(C)和料液質(zhì)量濃度(D)之間的回歸模型為:

Y=10.66-0.26A+0.055B-0.47C+0.082D+0.10AB+0.55AC-0.14AD-0.59BC+0.28BD+0.27CD-1.67A2-1.10B2-1.0C2-2.44D2

式中：A、B、C、D為各因素編碼．

上述回歸方程的方差分析結(jié)果見表3．由表3可知,A2、B2、D2對麥谷蛋白水解度的影響極顯著(P<0.01),C2對麥谷蛋白水解度的影響較顯著(P<0.05),其余的對麥谷蛋白水解度的影響均不顯著(P>0.05)．

表3 回歸模型的方差分析

注:“*”差異顯著(P<0.05),“**”差異極顯著(P<0.01)

另外,從表3也可看出,該響應(yīng)面回歸模型極顯著(P<0.01),失擬項不顯著(P>0.05),說明采用該模型分析和預(yù)測不同處理條件對麥谷蛋白水解度的影響是比較合適的[16]．從各個因素的顯著性水平差異可見,各因素對麥谷蛋白水解度的影響依次為C(水/離子液體比值)>A(超聲功率)>D(料液質(zhì)量濃度)>B(超聲時間)．

(2) 最優(yōu)工藝條件確定及驗證

根據(jù)麥谷蛋白水解度與各因子的回歸模型可知,各因子的二次項系數(shù)均為負(fù)值,說明拋物線開口朝下,響應(yīng)值Y存在極值,可由回歸方程確定最優(yōu)工藝條件．對二次回歸的數(shù)學(xué)模型求一階偏導(dǎo)可得到以下4個4元一次方程:

3.34A-0.10B-0.55C+0.14D+0.26=0

(1)

0.10A-2.2B-0.59C+0.28D+0.055=0

(2)

0.55A-0.59B-2.0C+0.27D-0.47=0

(3)

0.14A-0.28B-0.27C+4.88D-0.082=0

(4)

對方程(1)、(2)、(3)和(4)求解得A=-0.124 22,B=0.100 36,C=-0.297 46,D=0.009 67．從而確定最佳超聲-離子液體輔助麥谷蛋白酶解的最優(yōu)工藝條件為:超聲功率287.7 W,超聲時間6.3 min,水/離子液體體積比值0.85∶1,底物濃度20 g/L．在此條件下,麥谷蛋白水解度的預(yù)測值為10.74%．對上述最佳處理條件進(jìn)行驗證,經(jīng)3 次平行性實驗,得到麥谷蛋白水解度分別為10.62%、10.71%、10.68%,平均值為10.67%±0.046%．可見,實驗值與理論預(yù)測值非常接近．表明模型可靠．而未經(jīng)處理的麥谷蛋白在相同酶解條件下的水解度為7.13%±0.091%(3 次平行性實驗分別為7.21%、7.03%、7.14%)．本研究結(jié)果表明,超聲-離子液體處理提高了麥谷蛋白的水解度,且比未處理組的水解度提高了49.65%．

(3) 超聲-離子液體處理對麥谷蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

超聲-離子液體處理對麥谷蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基能力的影響如圖5．

圖5 超聲-離子液體處理對麥谷蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性的影響Fig.5 Effect of ultrasound-ionic liquids treatment onscavenging DPPH radical activity of glutenin hydrolysates

從圖5可以看出,麥谷蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性比Vc的低;在麥谷蛋白酶解產(chǎn)物濃度為20～100 μg/mL時,麥谷蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率會隨著產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加而增大．利用Excel軟件分析處理數(shù)據(jù),得到未處理和超聲-離子液體處理的回歸方程分別為:y=-0.002 5x2+0.713 9x+3.069(R2=0.996 3)和y=-0.002 5x2+0.71x+11.36(R2=0.997 3),回歸方程的相關(guān)指數(shù)顯著．由回歸方程可計算得到麥谷蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的IC50值分別為102.58和73.40 μg/mL,超聲-離子液體處理的酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性比未處理的提高了28.45%．

超聲-離子液體處理對麥谷蛋白Fe2+螯合能力的影響如圖6．從圖6可以看出,EDTA-2Na的Fe2+螯合能力最大,超聲-離子液體處理麥谷蛋白酶解產(chǎn)物對Fe2+螯合能力比未處理的強(qiáng),在麥谷蛋白酶解產(chǎn)物濃度為10～50 μg/mL時,麥谷蛋白酶解產(chǎn)物對Fe2+螯合能力會隨著質(zhì)量濃度的增加而增加．利用Excel軟件分析處理數(shù)據(jù),得到未處理和超聲-離子液體處理的回歸方程分別為:y=-0.041 4x2+3.704 5x-13.676(R2=0.985 7)和y=-0.035 3x2+3.466 6x-4.888 9(R2=0.980 5)．由回歸方程可得未處理和超聲-離子液體處理的麥谷蛋白酶解產(chǎn)物螯合Fe2+的IC50值分別為23.21和19.84 μg/mL．超聲-離子液體處理的麥谷蛋白酶解產(chǎn)物的Fe2+螯合能力比未處理的提高了14.52%．

圖6 超聲-離子液體處理對麥谷蛋白酶解產(chǎn)物螯合Fe2+能力的影響Fig.6 Effect of ultrasound-ionic liquids treatment onFe2+chelating capacity of glutenin hydrolysates

超聲-離子液體處理對麥谷蛋白還原力的影響如圖7．從圖7可以看出,隨著麥谷蛋白酶解產(chǎn)物濃度的增大,未處理和超聲-離子液體處理的麥谷蛋白酶解產(chǎn)物還原力均不斷增強(qiáng)．相同酶解產(chǎn)物濃度下,超聲-離子液體處理的麥谷蛋白酶解產(chǎn)物還原力比未處理的高．

圖7 超聲-離子液體處理對麥谷蛋白酶解產(chǎn)物還原力的影響Fig.7 Effect of ultrasound-ionic liquids treatment onreducing power of glutenin hydrolysates

研究結(jié)果表明,超聲-離子液體處理的麥谷蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性比未處理的高,這主要是因為超聲-離子液體耦合處理能夠強(qiáng)化處理效果,使麥谷蛋白內(nèi)部的堿性蛋白酶的作用位點充分暴露,更好地與酶結(jié)合,促進(jìn)酶解,有利于酶解釋放出活性更強(qiáng)的抗氧化肽,從而提高酶解產(chǎn)物的抗氧化活性[8,14]．

3 結(jié)論

(1) 本研究采用響應(yīng)面法對超聲-離子液體處理麥谷蛋白的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳工藝條件為:超聲功率287.7 W、超聲時間6.3 min、水/離子液體體積比值為0.85 ∶1、料液質(zhì)量濃度20 g/L,在此優(yōu)化條件下,麥谷蛋白的水解度可達(dá)到10.67%±0.046%．

(2) 經(jīng)超聲-離子液體處理后,酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性、Fe2+螯合力和還原力均比未處理時要高．麥谷蛋白通過超聲-離子液體處理后,其酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性和Fe2+螯合能力分別提高了28.45%和14.52%,且還原力也得到了改善．