番茄莖稈粗提物對(duì)5種植物病原真菌的生物活性初探

烏魯木齊縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，烏魯木齊 830011

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著十分重要的作用。隨著人們健康意識(shí)的提高，大多數(shù)國(guó)家都非常重視農(nóng)產(chǎn)品的安全性，對(duì)農(nóng)藥殘留的限制十分嚴(yán)格[1]。中國(guó)在加入WTO以后，農(nóng)產(chǎn)品出口面臨著非常嚴(yán)峻的“綠色壁壘”，其中農(nóng)藥殘留超標(biāo)是經(jīng)常遇到的問(wèn)題，嚴(yán)重影響了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力。為了降低農(nóng)藥殘留量，努力開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。

植物源農(nóng)藥來(lái)源于自然，能在自然界降解，一般不會(huì)污染環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品，在環(huán)境和人體中積累毒性的可能性不大，對(duì)人和牲畜相對(duì)安全，對(duì)害蟲(chóng)天敵傷害小，且害蟲(chóng)對(duì)其難以產(chǎn)生抗體，具有低毒、低殘留的特點(diǎn)，能夠保持農(nóng)產(chǎn)品的高品質(zhì)，因此植物源農(nóng)藥具有廣闊的市場(chǎng)[2～3]。植物源農(nóng)藥就是利用植物的某些部位或提取其有效成分制成具有殺蟲(chóng)或殺菌作用的農(nóng)藥。植物源農(nóng)藥在我國(guó)常被稱(chēng)為土農(nóng)藥，具有高效、無(wú)公害、能與環(huán)境相容、作用機(jī)理獨(dú)特及開(kāi)發(fā)費(fèi)用低廉等特點(diǎn)，具有明顯的生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。近二十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外投入了大量的人力物力進(jìn)行植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)和研究，經(jīng)大田實(shí)驗(yàn)顯示其高效低毒，具有良好的開(kāi)發(fā)前景[4～5]。

植物真菌病害仍以化學(xué)藥劑防治為主，長(zhǎng)期大量地使用化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)了環(huán)境污染，農(nóng)藥殘留等問(wèn)題。農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為當(dāng)今世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品出口的嚴(yán)重障礙，從生物體特別是植物體中尋找新的高效，低毒，低殘留與環(huán)境相容性好的殺菌抑菌活性物質(zhì)，已成為當(dāng)今新農(nóng)藥研究開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。在有害生物的可持續(xù)控制中,生物防治將成為控制農(nóng)業(yè)生物災(zāi)害、保護(hù)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境健康的重要手段。而作為生物防治重要組成部分的植物源農(nóng)藥，加速其產(chǎn)業(yè)化是順應(yīng)人類(lèi)生活質(zhì)量提高和社會(huì)進(jìn)步的必然選擇，是保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展重要手段，是今后農(nóng)藥工業(yè)發(fā)展的方向。

番茄（Lcopesion esaclentum Min）屬茄科茄屬植物，是一種重要農(nóng)業(yè)栽培作物，也是一種重要的茄果類(lèi)蔬菜，每年產(chǎn)生大量目前尚不被利用的番茄莖稈。番茄莖稈散發(fā)出特殊氣味，國(guó)內(nèi)外主要研究了其氣味組成而對(duì)番茄莖稈的農(nóng)藥生物活性研究甚少。馮俊濤發(fā)現(xiàn)番茄莖葉丙酮提取物有抑菌活性。楊從軍，孟昭禮等人采用6種溶劑對(duì)番茄莖葉進(jìn)行系統(tǒng)抽提，并選取了8種重要植物病原菌進(jìn)行抑菌活性篩選[6～9]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上采用其他四種不同溶劑進(jìn)行提取，對(duì)其抑菌活性作更全面的分析，為從番茄莖葉中研制開(kāi)發(fā)新型植物源殺菌劑提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 番茄莖稈：采自塔里木大學(xué)科技學(xué)院試驗(yàn)田，陰干，粉碎機(jī)粉碎(≤2 cm)，備用。

1.1.2 供試菌種

蘋(píng)果輪紋病菌(Macrophoma kawatsukai)，蘋(píng)果褐腐病菌（Monilia fructigena），玉米小斑病菌（Bipolarismaydis），棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.)，棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）(以上菌種由植物病理實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，YP2001N型)、高壓蒸汽滅菌鍋（上海精密科學(xué)儀器有限公司，HVE-50型）、電磁爐（中山市正夫人電器有限公司，K22型）、滅菌恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，MJX-250B-Z型）、水浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠，HZSH型）、潔凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，SW-CJ-ZFED型）、冰箱（長(zhǎng)嶺股份有限公司，BCD-218型）、格蘭士微波爐（廣東格蘭士集團(tuán)有限公司，B8023CTL-K4），移液槍?zhuān)ㄉ虾＿^(guò)望化工有限公司，G200型）。

1.2.2 試劑

葡萄糖、瓊脂條、蒸餾水、無(wú)菌水(自制)、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇(以上均為分析純,萊陽(yáng)康德化工廠生產(chǎn))。

2 試驗(yàn)方法

2.1 番茄莖稈化學(xué)成分提取

稱(chēng)取備用的番茄莖稈粉末1 000 g，按1：6(W∶V)加入80%乙醇，常溫提取7 d，過(guò)濾，減壓濃縮成浸膏，無(wú)菌水制成懸浮液，以一體積石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇依次萃取，各3次，合并萃取液，減壓濃縮至一定體積，相應(yīng)溶劑定容至一定體積，即為供試原液（濃度均為干莖稈含量10 g/mL）。

2.2 培養(yǎng)基的制備

稱(chēng)取馬鈴薯200 g，將其切成塊狀放入鍋中，加1 000 ml水煮沸30 min，然后用2～3層紗布過(guò)濾，取濾液定容至1 000 ml，將濾液倒入鍋中，加入15～20 g瓊脂條，加熱至瓊脂條融化，加入葡萄糖定容到1 000 ml，分裝于三角瓶中，三角瓶加入99 ml、98 ml、95 ml PDA封口滅菌，以備做不同濃度的溶劑相對(duì)植物病原菌抑菌活性的測(cè)定。

2.3 供試菌種的準(zhǔn)備

將上述菌種在無(wú)菌條件下接入PDA培養(yǎng)基中置于恒溫培養(yǎng)箱中，溫度26～28℃連續(xù)培養(yǎng)幾代后，在試驗(yàn)前3～5 d再接種一次培養(yǎng)備用。

2.4 帶藥平板培養(yǎng)基的制備

分別取2.1制備的供試原液1 ml、2 ml、5 ml，加入到40℃左右的99 ml、98 ml、95 mlPDA的三角瓶中，使之與下述各表格中的各個(gè)濃度相對(duì)應(yīng)，搖勻，然后將混藥PDA倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，以等量的相應(yīng)提取溶劑加到培養(yǎng)基中做為對(duì)照。

2.5 接菌

在無(wú)菌條件下，將供試菌種用4 mm打孔器自菌落邊緣打取菌餅并打制出適量的菌餅，用鑷子接入已制備好的帶藥平板培養(yǎng)基上，有菌絲的一面朝下，每個(gè)培養(yǎng)皿中放一個(gè)菌餅，將藥劑名稱(chēng)和菌種用記號(hào)筆做好標(biāo)記，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.6 檢查結(jié)果

培養(yǎng)36 h，72 h，108 h后，分別用直尺測(cè)量一次菌落直徑（用十字交叉法測(cè)兩次取其平均值），根據(jù)下列公式計(jì)算菌落直徑和抑制率。

純生長(zhǎng)量=測(cè)量菌落平均值－菌餅直徑；

菌餅直徑=4（mm）；

3 結(jié)果與分析

3.1 番茄莖稈不同溶劑相對(duì)病原菌的抑菌作用測(cè)定結(jié)果

表1 番茄莖稈不同溶劑相抑菌作用測(cè)定結(jié)果

由表1可以看出，番茄莖稈萃取后相對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌表現(xiàn)出一定的抑菌活性為68.42%，對(duì)其余幾種病原菌的抑制率普遍較低，分別為棉花黃萎病菌35.80%,棉花枯萎病菌24.09%，蘋(píng)果褐腐病菌34.43%,其中對(duì)玉米小斑病菌還起到促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，為-46.51%。

番茄莖稈正丁醇相對(duì)棉花黃萎病菌，棉花枯萎病菌和蘋(píng)果輪紋病菌有強(qiáng)烈的抑制作用，抑菌率均為100%。對(duì)玉米小斑病菌的抑制效果也相當(dāng)好，在各濃度下抑制率均可達(dá)到85%以上。

番茄莖稈石油醚相對(duì)5種病原菌的抑制作用差異顯著，對(duì)棉花黃萎病菌有強(qiáng)烈的抑制作用，抑菌率為100%。而對(duì)棉花枯萎病菌和蘋(píng)果輪紋病菌的抑制活性較低，對(duì)蘋(píng)果褐腐病菌和玉米小斑病菌還表現(xiàn)出刺激生長(zhǎng)的作用，尤其是在低濃度下對(duì)玉米小斑病菌的促進(jìn)作用非常明顯。

番茄莖稈乙酸乙酯相對(duì)5種植物病原菌有強(qiáng)烈的抑制作用，抑制率均可達(dá)到100%。由此可知，番茄莖稈中含有種類(lèi)豐富的對(duì)供試菌具有一定的次生代謝物質(zhì)。抽提溶劑無(wú)論極性強(qiáng)弱，從非極性的石油醚到強(qiáng)極性的水，每種抽提液都對(duì)一些病原菌有一定的抑制活性。

3.2 番茄莖稈不同溶劑相抑菌活性比較

由表1據(jù)作圖1、圖2、圖3、圖4，分別為0.1 g/ml、0.2 g/ml、0.5 g/ml的番茄莖稈不同溶劑相抑菌活性總體比較。

3.2.1 石油醚相

圖1 石油醚相對(duì)五種病原菌抑菌活性

從圖1可以看出∶番茄莖稈的石油醚相對(duì)供試的五種病原菌的抑制效果差異顯著，對(duì)棉花黃萎病菌抑制率最高可達(dá)100%，在各濃度下均有較好的抑制效果。對(duì)棉花枯萎病菌和蘋(píng)果輪紋病菌的抑制效果一般，抑制率均在40%以下。石油醚相對(duì)蘋(píng)果褐腐病菌在0.2 g/mL條件下有輕微的抑制作用，在其他濃度下有輕微促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。石油醚相在各濃度下對(duì)玉米小斑病有不同程度的促進(jìn)作用。

3.2.2 酸乙酯相

圖2 乙酸乙酯相對(duì)五種病原菌抑菌活性

從圖2可以看出∶番茄莖稈乙酸乙酯相對(duì)棉花黃萎病菌的抑制活性較高，各濃度下均接近100%。在濃度為0.5 g/ml番茄莖稈的乙酸乙酯相對(duì)供試的5種病原菌的綜合抑制效果最好，均可到達(dá)100%，對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌效果最差也為91.89%。

3.2.3 丁醇相

圖3 正丁醇相對(duì)五種病原菌抑菌活性

從圖3可以看出：對(duì)棉花枯萎病菌的綜合抑制效果較好，對(duì)棉花黃萎病菌的抑制效果一般。對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌在0.1 g/ml時(shí)有抑制作用，在其他濃度下均有輕微的促進(jìn)作用。正丁醇相對(duì)玉米小斑病菌在0.1 g/ml、0.2 g/ml時(shí)抑制效果較好，但在0.5 g/ml時(shí)反而有一定的促進(jìn)作用。

3.2.4 萃取后相

圖4 萃取后相對(duì)五種病原菌抑菌活性

從圖4可以看出：番茄莖稈萃取后相對(duì)供試的五種病原菌的綜合抑制效果較差，除了蘋(píng)果輪紋病菌在0.2 g/ml時(shí)抑制率可達(dá)70%，對(duì)其余病原菌在各濃度下均低于50%，萃取后相對(duì)玉米小斑病在各濃度下還有不同程度的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。

4 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，番茄莖稈的四種提取物對(duì)特定病菌都有一定的抑制作用，但抑制活性差異較大。番茄莖稈石油醚相對(duì)5種病原菌的抑制作用差異顯著，對(duì)棉花黃萎病菌有強(qiáng)烈的抑制作用，抑菌率為100%。而對(duì)棉花枯萎病菌和蘋(píng)果輪紋病菌的抑制活性較低，對(duì)蘋(píng)果褐腐病菌和玉米小斑病菌還表現(xiàn)出刺激生長(zhǎng)的作用，尤其是在低濃度下對(duì)玉米小斑病菌的促進(jìn)作用非常明顯。

當(dāng)濃度為0.5 g/ml時(shí)，番茄莖稈的乙酸乙酯相對(duì)供試的五種病原菌的綜合抑制效果最好，均可到達(dá)100%，對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌效果最差也為91.89%。

番茄莖稈正丁醇相對(duì)棉花黃萎病菌，棉花枯萎病菌和蘋(píng)果輪紋病菌有強(qiáng)烈的抑制作用，抑菌率均為100%。對(duì)玉米小斑病菌的抑制效果也相當(dāng)好，在各濃度下抑制率均可達(dá)到85%以上。

番茄莖稈萃取后相對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌表現(xiàn)出一定的抑菌活性為68.42%，對(duì)其余幾種病原菌的抑制率普遍較低，分別為棉花黃萎病菌35.80%,棉花枯萎病菌24.09%，蘋(píng)果褐腐病菌34.43%,其中對(duì)玉米小斑病菌還起到促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，為–46.51%。

抽提溶劑無(wú)論極性強(qiáng)弱，從非極性的石油醚到強(qiáng)極性的水，每種抽提液都對(duì)一些病原菌有一定的抑制活性，說(shuō)明番茄莖稈中含有種類(lèi)豐富的對(duì)供試菌具有一定抑制作用的次生代謝物質(zhì)。番茄莖稈的乙酸乙酯相對(duì)供試的五種病原菌的綜合抑制效果最好，因此乙酸乙酯可以作為番茄莖稈抑菌活性成分提取的首選溶劑。