凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法分析

◎ 李杉杉

（眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 眉山 620000）

蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)非常重要，幾乎參與所有的生命活動(dòng)，蛋白質(zhì)不僅與新陳代謝、免疫和生物進(jìn)化有很大關(guān)系，而且還提供很多信息。蛋白質(zhì)含量常作為衡量食品中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高低的一項(xiàng)重要指標(biāo)，因此蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)在食品分析中尤為重要，一直以來都是研究的熱點(diǎn)。

根據(jù)GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，在食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有凱氏定氮法、分光光度法和燃燒法[1]。雖然凱氏定氮法操作復(fù)雜、試劑消耗大，但其測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好，是目前測(cè)定有機(jī)化合物含氮量最常用，也是最經(jīng)典的方法之一[2]。本文分析凱氏定氮法在實(shí)際操作中存在的問題。

1 測(cè)定原理及儀器

1.1 測(cè)定原理

凱氏定氮法是測(cè)定化合物或混合物中總氮量的一種方法[3]，在食品中的蛋白質(zhì)在催化劑催化并加熱條件下，蛋白質(zhì)分解后的產(chǎn)物氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收游離氨后以標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量[4]。

1.2 儀器與試劑

（1）儀器。天平、定氮蒸餾裝置、自動(dòng)凱氏定氮儀和消化爐。

（2）試劑。硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍(lán)指示劑、氫氧化鈉和95%乙醇。

2 測(cè)定方法優(yōu)點(diǎn)及存在的問題

2.1 測(cè)定方法優(yōu)點(diǎn)

2.1.1 準(zhǔn)確度高

凱氏定氮的測(cè)定結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，在國(guó)內(nèi)各大檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)中比較普及。

2.1.2 靈敏度低，抗干擾

凱氏定氮法的靈敏度低、干擾少，適用于0.2～1.0 mg氮，誤差為（±2%），且樣品使用量少[5]。

2.1.3 應(yīng)用廣泛

凱氏定氮法應(yīng)用很廣泛，幾乎適用所有形態(tài)的食品，對(duì)于一些類似于不溶解的樣品，也能適用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)。

2.1.4 使用設(shè)備簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低

凱氏定氮法需要的設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，所需設(shè)備和試劑較少，實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑價(jià)格相對(duì)便宜，且實(shí)驗(yàn)操作難度小。

2.2 測(cè)定過程中存在的問題

2.2.1 消化時(shí)間過長(zhǎng)

采用凱氏定氮法測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量所需時(shí)間較長(zhǎng)，完成整個(gè)操作流程需要7～10 h，且試劑消耗量大。

2.2.2 消化過程中易產(chǎn)生泡沫，掛壁，導(dǎo)致消化不完全

食品中的有機(jī)物質(zhì)除了蛋白質(zhì)外，還有脂肪和糖類等，在加熱過程中易產(chǎn)生泡沫附在定氮瓶口或者消化管口，同時(shí)消化過程中產(chǎn)生的冷凝酸液不易將吸附物質(zhì)洗下，導(dǎo)致消化物質(zhì)減少，測(cè)定結(jié)果偏低。

2.2.3 消化液易產(chǎn)生結(jié)晶、渾濁

待消化完成后，在定容過程可以發(fā)現(xiàn)消化液過于黏稠，且有部分結(jié)晶物質(zhì)，導(dǎo)致消化液不澄清、透明。

2.2.4 定氮蒸餾裝置搭建復(fù)雜，玻璃材質(zhì)易破碎

常規(guī)定氮蒸餾裝置由電爐、水蒸氣發(fā)生器、反應(yīng)室、冷凝管、接收瓶等組成，組裝搭建整個(gè)定氮蒸餾裝置較復(fù)雜，同時(shí)各接口處比較脆弱，易破碎。

3 針對(duì)問題的解決方法

3.1 改變消化試劑的添加時(shí)間、添加量、添加種類

針對(duì)消化時(shí)間較長(zhǎng)問題，可以采用定時(shí)定量添加消化試劑，在添加硫酸的基礎(chǔ)上，添加少量的過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑可加速有機(jī)物的氧化分解。

3.2 消化注意溫度的把控，添加消泡劑

針對(duì)消化過程中易起泡問題，可以從控制溫度上解決。在消化初期溫度不需太高，保持消化液微沸即可，待泡沫消化后在徐徐漸進(jìn)的加強(qiáng)熱源，并定期旋轉(zhuǎn)定氮瓶，使掛壁物質(zhì)消化完全。針對(duì)脂肪、糖類含量特別高的食品還可以添加少量消泡劑如辛醇或液體石蠟或硅油。

3.3 注意催化劑的添加量

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中催化劑硫酸銅的添加量為0.4 g，無需多添加。如果添加過量消化結(jié)束后消化液冷卻后有可能會(huì)產(chǎn)生硫酸銅鹽結(jié)晶，可多加水、加熱使之溶解。但是產(chǎn)生的結(jié)晶不影響最終蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果。針對(duì)消化液不易透明、澄清，可以待消化液冷卻后加入少量的過氧化氫后繼續(xù)消化至澄清、透明。

3.4 采用自動(dòng)凱氏定氮儀

針對(duì)常規(guī)蒸餾裝置的復(fù)雜性、易損性，可以采用自動(dòng)凱氏定氮儀。不僅操作簡(jiǎn)單，同時(shí)可以縮短常規(guī)蒸餾裝置加熱時(shí)間，但是自動(dòng)定氮儀較常規(guī)玻璃蒸餾裝置會(huì)耗用更過的試劑。

4 結(jié)語

作為三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，蛋白質(zhì)是食品理化分析的重要指標(biāo)。而目前凱氏定氮法測(cè)定食品中蛋白質(zhì)含量是各大企業(yè)、檢測(cè)機(jī)構(gòu)采用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法之一，也是各高校學(xué)生主要學(xué)習(xí)的方法。凱氏定氮法測(cè)定過程中出現(xiàn)的問題均可以解決，需要各企業(yè)、機(jī)構(gòu)結(jié)合產(chǎn)品自身做出相應(yīng)調(diào)整。