糞便和毛發(fā)取樣法在麝科動物中的研究進展

索麗娟,強曉鳴,唐 婕,王 艷*

(1.陜西省動物研究所，陜西 西安 710032；2.陜西省秦嶺珍稀瀕危動物保育重點實驗室，陜西 西安 710069；3.陜西牛背梁國家級自然保護區(qū)管理局，陜西 西安 710100)

麝(Moschus)是珍稀瀕危資源動物，屬偶蹄目麝科，生性孤僻，膽小機警，是亞洲的特有種。中國是世界上麝科動物最為豐富的國家[1]。麝(Moschus)包括:原麝(Moschusmoschiferus)，林麝(Moschusberezovskii)，馬麝(Moschuschrysogaster)，喜馬拉雅麝(Moschusleucogaster)，黑麝(Moschusfuscus)和安徽麝(Moschusanhuiensis)[2]。成年雄麝分泌的麝香是珍貴的藥用材料和香料。長期以來，彌足珍貴的麝香驅(qū)動了非法狩獵活動，麝資源長期經(jīng)受過度利用的巨大壓力，野生種群數(shù)量銳減[3]。在持續(xù)受到人類獵殺和生境破碎化雙重脅迫的情況下，國務(wù)院將麝屬動物所有種列為中國Ⅰ級重點保護物種。同時，林麝被列為CITES 附錄Ⅰ物種，《中國瀕危動物紅皮書》將麝列為瀕危或易危動物[4-5]。為保護野生麝種群及可持續(xù)利用麝資源，中國科技工作者早在20世紀50年代末即著手麝類遷地保護、馴養(yǎng)及麝香資源的人工保育等前瞻性探索。

非損傷性取樣(non-invasive sampling)是在不觸及動物或低干擾動物正?；顒拥那闆r下，收集脫落的毛發(fā)或羽毛、糞便、尿液、食物殘渣(含有口腔脫落細胞)、鹿角、魚鱗和卵殼等樣品[6-7]。其中收集糞便和毛發(fā)在麝科動物中應(yīng)用最為廣泛。本文就這兩種取樣法在麝科動物中的研究及應(yīng)用做簡要概述。

1 糞便取樣

收集糞便樣品無需對麝抓捕，大大降低了對它的干擾。獲取的糞便樣品不僅可以提取DNA進行分子生物學(xué)研究，還可以提取類固醇激素及其代謝產(chǎn)物，進行麝生理學(xué)研究。

1.1 糞便DNA

糞便經(jīng)過腸道排出體外，其中含有大量的腸壁脫落細胞、微生物細胞以及植物細胞等，故提取的基因組DNA是各種細胞基因組DNA的混合物[8]。排泄的糞便如果沒有及時收集，會導(dǎo)致糞便DNA一定程度的降解，進而可能降低后續(xù)PCR擴增成功率和增加基因分析錯誤率[9-10]。收集人工飼養(yǎng)麝的新鮮糞便樣品比較容易，而要獲取野生麝的新鮮糞便樣品有一定的難度。

要減緩樣品中DNA的降解，除了及時收集樣品，有效的保存方法也是必須的。根據(jù)不同的研究目的，研究者保存糞便的方法也不同。Song等[11]在鑒定林麝糞樣中寄生蟲種類時，將收集的糞便保存在2.5%的重鉻酸鉀溶液中并置于4 ℃冰箱中。周美麗等[12]、王立志等[13]分別進行林麝糞便細菌、古菌多樣性研究時，將獲取的糞便樣品-80℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

國內(nèi)外研究者對麝類動物糞便DNA進行相關(guān)研究時，采用了不同的提取方法。結(jié)合其他物種的糞便DNA提取方法[14-16]，康強等[9]采用改良的CTAB法提取了林麝糞便DNA，進行常規(guī)PCR，能特異地擴增出mtDNA D-loop區(qū)和Cyt b基因。唐婕等[17]比較了常規(guī)試劑盒(Fast DNA SPIN Kit for fence)法和改良的試劑盒法(磷酸緩沖液處理之后，使用Biospin Cell Genomic DNA Extraction Kit)提取林麝糞便的效率，結(jié)果顯示改良的試劑盒法可以顯著提高林麝糞便DNA的獲得率。

1.2 糞便類固醇激素

動物體內(nèi)類固醇激素是一類四環(huán)脂肪烴化合物，是哺乳動物內(nèi)分泌系統(tǒng)的內(nèi)源性物質(zhì)，能夠有效反映機體的生理狀態(tài)[18]。通過類固醇激素及其代謝物的測定可以監(jiān)測野生動物或瀕危物種的生殖狀態(tài)和生理壓力，對野生動物的保護具有重要意義[19-20]。從糞便中檢測到的一般都是類固醇激素的代謝物，而不是源激素，這些物質(zhì)經(jīng)膽汁分泌到腸道內(nèi)，通過糞便排出體外[21-24]。

研究表明，由于糞便中細菌的作用，糞便中的類固醇激素的含量會隨著時間發(fā)生變化[25-26]，并且糞團表層和內(nèi)部類固醇激素含量存在顯著差異[27]。所以在研究中為了使試驗結(jié)果更加準確可靠，應(yīng)統(tǒng)一樣品采樣時間，盡量采集新鮮的糞便，并將糞樣充分混合均勻。人工飼養(yǎng)的林麝有相對固定的排便時間和地點，為了獲取新鮮的糞樣，國內(nèi)的研究者會在08: 00～10: 00或者更早時間進行采樣[28-29]。樣品采集之后通常會采用冷凍保存法保存，即采樣之后，低溫運送到實驗室，-20 ℃冰箱冷凍保存[29-30]。郎冬梅等[28]試驗比較了林麝糞樣中類固醇激素及其代謝物的三種保存方法，即不作處理常溫(20 ℃)保存、90%甲醇保存和加入0.9%抗生素保存，結(jié)果表明，對比抗生素保存，用甲醇保存是一種較好的保存林麝糞便類固醇激素的方法，并且不同激素(孕酮、睪酮、雌二醇等)用甲醇保存的有效時間不同。所以在實際工作中，我們應(yīng)根據(jù)研究工作的條件和研究對象(激素類別)來確定保存方法。

雖然研究者提取麝類糞樣類固醇激素的方法有所不同，但大都是參照Isobe等[31]和Cppezzuto等[32]的方法進行操作的，采用一定濃度的甲醇和乙醇溶液提取，用甲醇分裝回收，-20 ℃以下保存，直到進行免疫測定 。

常用的類固醇激素檢測方法主要有放射免疫吸附法(radioimmnoassay，RIA)[30]和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme immunoassay，EIA)[28-29]，這兩種方法各有優(yōu)劣，RIA靈敏度高，但是在試驗過程中會有一定的輻射。EIA相對來說靈敏度低，但是操作簡單安全。具體采用哪種方法，根據(jù)研究者具體的實驗條件來選擇。李春等[33]在進行小熊貓類固醇激素的研究中提到，當類固醇激素樣品中的甲醇濃度超過10%時，測得濃度較甲醇含量為0%時降低了27.9%～60.6%。在麝類研究中也應(yīng)該考慮到所用的甲醇對檢測的影響，可以嘗試在樣品檢測前用緩沖液進行一定比例的稀釋[34]。

2 毛發(fā)的非損傷取樣

從毛發(fā)中提取DNA具有無創(chuàng)傷性、方便長途運輸和簡易保存、一次采樣可重復(fù)性使用等優(yōu)點[35]。與糞便相比，毛發(fā)采樣保存比較簡單，即低溫冷凍保存?zhèn)溆谩NA主要存在于毛發(fā)的毛囊內(nèi)。毛囊組織含有較多的角蛋白，所以提取毛發(fā)DNA時都需要蛋白酶K進行消化?，F(xiàn)在從毛囊中提取DNA，普遍采用直接經(jīng)蛋白酶K消化后，再用酚-氯仿多次抽提的方法或蛋白酶K消化與Chelex100 相結(jié)合的方法[36]。白康等[35]采用PCR儀法從林麝毛發(fā)中提取基因組DNA，并與傳統(tǒng)的酚-氯仿法比較。結(jié)果表明PCR 儀法與酚-氯仿法相比操作簡單，提取所得的 DNA 質(zhì)量較高。

3 糞便和毛發(fā)取樣法的缺點

從保護生物學(xué)角度來說，提取麝類糞便和毛發(fā)進行科學(xué)研究具有很大優(yōu)勢，但也存在一定的局限性。主要缺點為：(1)與血液或組織提取DNA相比，糞便和毛發(fā)獲取的DNA含量低；(2)與血液提取類固醇激素相比，從糞便中獲取類固醇激素的方法更復(fù)雜，步驟繁瑣。

4 非損傷取樣法的應(yīng)用

4.1 遺傳多樣性研究

人工養(yǎng)殖林麝是林麝資源保護的一種手段。進行生物保護在很大程度上是保護生物的遺傳多樣性及其進化潛力[37]。由于圈養(yǎng)種群的奠基者數(shù)量往往比較少，長期近親繁殖會導(dǎo)致種群退化、免疫力低下、成活率低[38]，故對圈養(yǎng)林麝種群進行遺傳多樣性研究，有利于制定科學(xué)的養(yǎng)殖管理策略，從而更加經(jīng)濟有效地保護林麝優(yōu)良種質(zhì)資源。部分研究者提取林麝毛發(fā)DNA，運用主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex，MHC)、線粒體控制區(qū)(D-loop區(qū))、微衛(wèi)星等分子標記對四川省和陜西省鳳縣多地圈養(yǎng)種群進行遺傳多樣性分析[39-42]，以便了解現(xiàn)有人工飼養(yǎng)種群的遺傳多樣性水平及種群間結(jié)構(gòu)與遺傳分化程度，從而優(yōu)化林麝圈養(yǎng)繁育項目規(guī)劃，制定合適的引種、育種策略。

4.2 疾病的研究

我國林麝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，麝類疾病(胃腸道疾病、寄生蟲病、肺炎、膿腫病等[43-45])是制約麝人工養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。胃腸道疾病是由腸道微生物菌群失調(diào)引起的，研究者通過16S-rRNA高通量測序技術(shù)比較不同麝群體(健康林麝和腹瀉林麝、圈養(yǎng)林麝與野生林麝、林麝與馬麝)糞樣中的腸道微生物，分析菌群多樣性以及主要菌群等，為胃腸疾病診斷提供理論依據(jù)，為林麝野化放歸項目研究提供參考[46-48]。而當動物體內(nèi)出現(xiàn)寄生蟲時，蟲體的卵或成體可以通過糞便排出[37]。收集并提取糞便DNA，通過基因的特異性引物進行PCR擴增、序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建等，即可以準確判斷林麝寄生蟲病的發(fā)生情況[49-51]。以上研究結(jié)果為胃腸道疾病和寄生蟲病的防控、診斷與治療提供了理論依據(jù)和新的視角。

4.3 應(yīng)激反應(yīng)監(jiān)測

應(yīng)激(stress)是機體對外界或內(nèi)部各種刺激所產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和，是機體應(yīng)對各種生存脅迫因子而產(chǎn)生的一種生理適應(yīng)[52]。應(yīng)激水平的高低主要通過皮質(zhì)醇激素濃度來反映。He等[53]研究發(fā)現(xiàn)越是擁擠環(huán)境中的雌性林麝糞便皮質(zhì)醇濃度越低，說明長期的擁擠影響了林麝的應(yīng)激狀態(tài)。在人工養(yǎng)殖過程中，應(yīng)該考慮林麝對空間的需求。非孕期圈養(yǎng)林麝皮質(zhì)醇激素的測定結(jié)果表明，雌性林麝在幼仔臥巢哺乳期、幼仔出巢哺乳期、幼仔單獨飼養(yǎng)期、發(fā)情期四個不同階段，皮質(zhì)醇水平會呈現(xiàn)一定的波動規(guī)律，且第一階段處于較高的應(yīng)激水平，應(yīng)以雌麝的管護為主[39]。李瓊[54]研究發(fā)現(xiàn)原麝皮質(zhì)醇水平與睪酮和雌二醇水平呈顯著相關(guān)性，說明生殖壓力會使動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。因此，糞便類固醇激素水平的測定可以做為評估麝科動物管護和科學(xué)實驗中所遇到的各種刺激的一種有效手段。

4.4 卵巢功能和妊娠監(jiān)測

Mithileshwari等[55]通過EIA測定了馬麝三種孕前激素，發(fā)現(xiàn)測定交配后前三個月的孕二醇-3葡糖苷酸(PdG)水平是監(jiān)測妊娠的有效手段。Wang等[56]通過對林麝孕酮水平的測定可知，林麝的發(fā)情周期為24.3±0.5 d，黃體間期為21.6±0.5 d，黃體期為2.7±0.3 d；林麝在妊娠2 w后糞便中孕酮濃度迅速增長，其濃度遠遠大于非孕期。故監(jiān)測糞樣中的孕激素水平是評估林麝卵巢功能和監(jiān)測妊娠的有效方法，將有助于提高圈養(yǎng)麝的繁殖率，并可用于監(jiān)測野外麝的繁殖狀況。

5 展 望

綜上所述，糞便和毛發(fā)取樣法在麝科動物健康狀況的評估、適應(yīng)性測定、遺傳多樣性、生殖生理監(jiān)測等方面的應(yīng)用顯得日益重要。

就麝科動物而言，糞便和毛發(fā)取樣法主要應(yīng)用在人工養(yǎng)殖群體中，在野外種群追蹤調(diào)查研究中涉及較少。2017年6月29日，13只經(jīng)過野化訓(xùn)練的人工繁育林麝在位于秦嶺深處的陜西省寧陜縣響潭溝正式啟動野化放歸。放歸后，陜西省動物研究所科研人員利用GPS項圈、自動感應(yīng)紅外相機技術(shù)等，對回歸自然的林麝進行監(jiān)測和野外巡護。建議結(jié)合糞便和毛發(fā)取樣法來了解它們的生境選擇、活動規(guī)律、繁殖狀況、疾病與寄生蟲、種內(nèi)與種間關(guān)系，為更大規(guī)模的野化放歸提供科學(xué)依據(jù)。

與其它物種相比，糞便和毛發(fā)取樣法在麝科動物的應(yīng)用還不夠廣泛，還未涉及到雄性繁殖能力評估、性別鑒定、親緣關(guān)系的鑒定等方面。相信隨著越來越多研究者進行麝科動物科學(xué)研究，該方法會不斷完善、推廣和普及。