哺乳動(dòng)物妊娠中miRNA的作用

韓志強(qiáng),宋興超,王海軍,賈 赟,趙家平,趙全民,邢秀梅,徐 超*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130112； 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130118；3. 吉林省野生動(dòng)物救護(hù)繁育中心，長(zhǎng)春 130119； 4.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心,大連 116001)

miRNA是一類(lèi)小的非編碼RNA，廣泛存在于動(dòng)物的血清、血漿、唾液、初乳、腹膜液、精液、卵泡液等生物體液中，并在人和許多動(dòng)物的生理(懷孕)和病理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。miRNA具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，在基因表達(dá)中起著“微調(diào)”而不是“開(kāi)關(guān)”的作用，并與多種細(xì)胞的代謝、分化、增殖和凋亡過(guò)程有關(guān)[1]。1997年Lo等[2]證實(shí)了母體血液中存在著部分的胎兒游離核酸，2000年P(guān)oon等[3]在母體血漿中檢測(cè)到游離胎兒RNA，2008年Chim等[4]在人體血液中檢測(cè)到妊娠特異性miRNA。同一物種血清中的胎盤(pán)miRNA水平在個(gè)體之間具有高度相似性[5]。由于血漿中存在的miRNA比mRNA更穩(wěn)定[4]，所以母體血漿中胎盤(pán)miRNA的含量可作為監(jiān)測(cè)胎盤(pán)基因調(diào)控的重要依據(jù)。除了血液，胎盤(pán)亦是miRNA高度富集的器官之一[6]，動(dòng)物胎盤(pán)功能和動(dòng)物妊娠與胎盤(pán)中的特異性miRNA簇具有十分重要的關(guān)系[7-9]。miRNA參與胚胎著床前子宮內(nèi)膜的發(fā)育[10]，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及免疫耐受相關(guān)基因在懷孕開(kāi)始與維持過(guò)程中的表達(dá)。

1 妊娠相關(guān)的miRNA簇

目前為止，已報(bào)道了600余種miRNA在人體胎盤(pán)的動(dòng)態(tài)表達(dá)。胎盤(pán)miRNA可通過(guò)3個(gè)miRNA簇內(nèi)的多種miRNA來(lái)表達(dá)，其中包括C14MC簇(chromosome 14 miRNA cluster, C14MC)、C19MC簇(chromosome 19 miRNA cluster, C19MC)以及miR-371-3簇[11-12]。特別是懷孕期間，妊娠相關(guān)胎盤(pán)miRNA 簇的表達(dá)量在不斷發(fā)生著變化[11, 13]。血液中的胎盤(pán)miRNA 主要來(lái)源于絨毛滋養(yǎng)層。miRNA 簇廣泛存在于母體血液循環(huán)中，所以對(duì)動(dòng)物妊娠診斷來(lái)說(shuō)具有極大的應(yīng)用潛力。

1.1 C14MC簇

C14MC又被稱(chēng)為Mirg簇[14]、miR-379/miR-410簇或miR-379 / miR- 656簇[15]，包含約52個(gè)miRNA基因(產(chǎn)生63個(gè)成熟miRNA)[11-12, 16]。C14MC簇在真哺乳亞綱物種中是保守的，僅由母本遺傳的等位基因(父本等位基因被甲基化)表達(dá)，并且主要在發(fā)育中的胚胎(頭和軀干)和胎盤(pán)組織表達(dá)，也在滋養(yǎng)層細(xì)胞高度表達(dá)[17]。C14MC簇具有促進(jìn)哺乳動(dòng)物胎盤(pán)進(jìn)化的作用[15]。

1.2 C19MC簇

C19MC簇位于19號(hào)染色體上，是迄今為止人染色體上最大的miRNA基因簇之一。C19MC屬靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的特異性miRNA家族，大鼠、小鼠以及狗的體內(nèi)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該miRNA簇的同源物[18]。C19MC簇包括了46個(gè)miRNA(產(chǎn)生58個(gè)成熟miRNA)[17]。與C14MC簇類(lèi)似的是，C19MC簇也位于印跡基因內(nèi)，與C14MC相反的是，C19MC受17.6 kb上游CpG啟動(dòng)子區(qū)甲基化控制，僅由父本遺傳等位基因表達(dá)[19]。印跡基因在細(xì)胞分化和命運(yùn)的調(diào)控中具有重要作用，并且它們大都僅在胚胎期或胎盤(pán)組織中表達(dá)。C19MC的表達(dá)主要受生殖系統(tǒng)和胎盤(pán)的影響[13]。研究表明，C19MC簇在胚胎發(fā)育中具有重要的作用，妊娠早期許多外周體液中C19MC簇miRNA表達(dá)量升高[20]。

1.3 miR-371-3簇

miR-371-3簇主要由hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-372和hsa-miR-373-3p產(chǎn)生的6個(gè)成熟RNA組成的。miR-371-3簇共享著相同種子序列“AAG UGC”，并且該共享相同種子序列miRNA超家族還包括小鼠同源物簇miR-290-295[9]。miR-371-3簇位于與C19MC簇下游約25 kb的1 050 bp區(qū)域內(nèi)[21]。與C14MC簇和C19MC簇類(lèi)似的是僅在哺乳動(dòng)物中高度保守，并且在胎盤(pán)中優(yōu)先表達(dá)[22]。現(xiàn)已證明，miR-371-3簇是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡必需的miRNA[23]，因此對(duì)胚胎發(fā)育具有重要的作用。

對(duì)哺乳動(dòng)物中人miRNA分析顯示，C19MC簇、C14MC簇和miR-371-3簇在胎盤(pán)組織中高度表達(dá)，并且其表達(dá)隨胎齡變化而變化[24]。C14MC簇和C19MC簇的水平在整個(gè)懷孕期間也不斷地發(fā)生變化。C14MC簇在第一孕周的滋養(yǎng)層細(xì)胞中高度表達(dá)，但在妊娠中期減少。與C14MC簇相反，C19MC簇在妊娠前期表達(dá)較低，但在妊娠末期高度表達(dá)。妊娠終止后，受胎盤(pán)影響C14MC簇和C19MC簇妊娠相關(guān)的miRNA表達(dá)水平顯著下降[11, 25]。胚胎與血液中的miRNA的變化反映并維持著動(dòng)物機(jī)體妊娠進(jìn)程，以miRNA鑒定為基礎(chǔ)進(jìn)行妊娠研究會(huì)是未來(lái)發(fā)展的大趨勢(shì)。

2 miRNA與早期妊娠診斷

早期妊娠診斷是哺乳動(dòng)物繁殖管理的重要環(huán)節(jié)，其對(duì)于提高動(dòng)物妊娠率尤為重要[26]。循環(huán)miRNA則對(duì)妊娠診斷具有潛在的預(yù)測(cè)性、特異性、敏感性，并且能以非侵入性的方式獲得，其檢測(cè)效率也相對(duì)較高[27-28]。Ioannidis和Donadeu[29]首次確定了牛早期妊娠期間血漿中miRNA的變化水平，發(fā)現(xiàn)了 10個(gè) 最豐富的miRNA，即bta-miR-133a、bta-miR-486、bta-miR-22-3p、bta-miR-19、bta-miR-191、bta-miR-423-5p、bta-miR-10b、bta-miR-142-5p、bta-miR-27b和bta-miR-30d，占總miRNA量的61%，其中，懷孕母牛第16天miR-133a表達(dá)水平比同期非懷孕小母牛高出7.4倍，并發(fā)現(xiàn)在懷孕16～24天期間miR-26a水平升高2倍以上。Ioannidis和Donadeu[30]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，最早可在牛妊娠第8天 檢測(cè)到miR-26a的水平明顯增加，另外，第16天 與第8天相比miR-101的水平也趨于升高。近期在豬和羊的研究中也發(fā)現(xiàn)，妊娠第20天時(shí)miR-26a在受孕卵巢中的表達(dá)水平出現(xiàn)增加[31-32]。在懷孕羊中還發(fā)現(xiàn)，miR-30c、miR-132、miR-379、miR-199a-3p和miR-320也出現(xiàn)差異表達(dá)。另有研究提出，bta-mir-140可作為早期妊娠診斷的分子生物標(biāo)志物[33]，這為研究者們通過(guò)miRNA進(jìn)行早期妊娠診斷提供了新的依據(jù)。近年來(lái)，諸多學(xué)者提出通過(guò)對(duì)奶中miRNA 譜高通量測(cè)序分析進(jìn)行妊娠診斷也具有十分重要的意義[34]。miRNA廣泛存在于血液[35]、唾液[36]、尿[37]和牛奶[38]等多種動(dòng)物體液中，這些體液中的miRNA將來(lái)均有望成為研究妊娠診斷理想的分子標(biāo)志物。

3 miRNA與妊娠相關(guān)疾病的關(guān)系

miRNA除了在正常妊娠中發(fā)揮作用，其動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力也有助于妊娠相關(guān)病癥的診斷，包括先兆子癇、異位妊娠、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、早產(chǎn)和胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等[39]。雖然懷孕期間miRNA作為標(biāo)志物的鑒定仍處于初期階段，但現(xiàn)在已經(jīng)篩選出了許多具有研究意義的miRNA?，F(xiàn)階段對(duì)于除人外的哺乳動(dòng)物妊娠疾病與miRNA研究較少，以下主要討論人常見(jiàn)懷孕異常引發(fā)的疾病與miRNA 特征性關(guān)系。

3.1 miRNA與先兆子癇的關(guān)系

先兆子癇(preeclampsia，PE)是指在哺乳動(dòng)物妊娠后半期、分娩期或分娩后期出現(xiàn)高血壓、蛋白尿或其他系統(tǒng)疾病的一種妊娠相關(guān)綜合征[40]。PE在人中發(fā)病率高達(dá)8%[41],然而PE在妊娠早期癥狀并不明顯，很難進(jìn)行診斷，因此尋找某種鑒定早期PE的方法至關(guān)重要。有研究表明，miRNA可參與PE的發(fā)病機(jī)制[42]。Ishibashi等[43]對(duì)人正常胎盤(pán)和PE胎盤(pán)之間的miRNA進(jìn)行大規(guī)模高通量測(cè)序，篩選出了先兆子癇胎盤(pán)中顯著上調(diào)的22種miRNA，為研究先兆子癇提供了有力依據(jù)。Yang等[44]研究發(fā)現(xiàn)，PE患者妊娠前3個(gè)月miRNA表達(dá)量有15個(gè) 上調(diào)，7個(gè)輕度下調(diào)。其中嚴(yán)重PE患者血漿中的miR-24、miR-26a、miR-103、miR-130b、miR-181a、miR-342-3p和miR-574-5p表達(dá)量升高。Loux等[45]在孕馬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，與PE有關(guān)的miR-204b和hsa-miR-204表達(dá)上調(diào)。De Bem等[46]證明，妊娠奶牛血液中hsa-miR-26a水平增加與妊娠有關(guān)，這種miRNA與先兆子癇相關(guān)。先兆子癇的發(fā)生可能是由母體和胎兒-胎盤(pán)循環(huán)中的血管內(nèi)皮功能障礙引起的，這種功能障礙會(huì)引起包括調(diào)節(jié)血管張力、膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能、內(nèi)皮存活或增殖、血管生成和代謝途徑等相關(guān)miRNA表達(dá)量發(fā)生改變。

3.2 miRNA與異位妊娠的關(guān)系

異位妊娠(ectopic pregnancy，EP)是指孕卵在子宮腔外著床發(fā)育的異常妊娠過(guò)程，也稱(chēng)“宮外孕”，孕婦發(fā)病率為1%～2%[47]?，F(xiàn)階段EP檢測(cè)主要有兩種方法，一種是陰道超聲檢查，但是經(jīng)陰道超聲不能準(zhǔn)確地確定EP；另一種是通過(guò)檢測(cè)母體血清中的人絨毛膜促性腺激素(HCG)和孕酮濃度，然而，通過(guò)血HCG和孕酮濃度對(duì)EP的診斷方法易產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果[48]。因此尋求一種快速、準(zhǔn)確鑒定異位妊娠的方法至關(guān)重要。Zhao等[48]為了尋找可以更準(zhǔn)確、敏感地鑒定人的異位妊娠生物標(biāo)志物，比較了發(fā)生自發(fā)流產(chǎn)(spontaneous abortion,SA)和正常妊娠(normal pregnancy,NP)的EP患兒血清樣本中妊娠相關(guān)miRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，EP或SA與NP相比，miR-517a、miR-519d和miR-525-3p的表達(dá)量較低，而miR-323-3p表達(dá)量明顯高于EP。Lu等[49]研究發(fā)現(xiàn)，SA和EP患者與正常孕婦相比，血清miRNA中的5種miRNA(miR-218、miR-233、miR-141、miR-873和miR-323)出現(xiàn)差異表達(dá)，并且miR-873作為單一標(biāo)記具有最高的靈敏度，EP檢測(cè)率高達(dá)61.76%。雖然對(duì)于miRNA異位妊娠研究較多，但現(xiàn)階段利用miRNA來(lái)檢測(cè)異位妊娠還不成熟，還需進(jìn)一步篩選特異性標(biāo)志物，通過(guò)HCG和孕酮與miRNA結(jié)合評(píng)估可以提高miRNA 作為生物標(biāo)志物的診斷性能，也可以提高異位妊娠的總體診斷效率。

3.3 miRNA與早產(chǎn)的關(guān)系

人早產(chǎn)(premature delivery，PTD)分娩的定義為在妊娠37周之前的分娩。對(duì)于除人外的哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，妊娠時(shí)間各有差異，因此對(duì)于早產(chǎn)的時(shí)間定義也有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，PTD患者中miRNA出現(xiàn)了差異表達(dá)[50-51]。Enquobahrie等[50]發(fā)現(xiàn)，人早產(chǎn)與miR-210和mir-223的含量增加相關(guān)。Pineles等[51]進(jìn)行了miRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)人絨毛膜中的39個(gè)miRNA在術(shù)前和早產(chǎn)組之間相比出現(xiàn)差異表達(dá)，miR-338、miR-449、miR-136和miR-199a表達(dá)出現(xiàn)下降。Mayor-Lynn等[52]分析了人早產(chǎn)和正常胎盤(pán)之間的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了20種差異表達(dá)miRNA，在早產(chǎn)孕婦胎盤(pán)中miR-15b、miR-181a、miR-210、miR-296-3p、miR-483-5p和miR-493等許多miRNA出現(xiàn)差異表達(dá)。Gray等[53]則證實(shí)，人母體血漿中miR-223表達(dá)升高與自發(fā)性早產(chǎn)相關(guān)，并認(rèn)為miR-223有望成為早期預(yù)測(cè)自發(fā)性早產(chǎn)的miRNA生物標(biāo)志物。另外，懷孕早期外周血中miRNA的定量分析對(duì)自發(fā)性早產(chǎn)的敏感和特異性預(yù)測(cè)也具有較高價(jià)值[54]。

4 miRNA與母乳的關(guān)系

母乳中含有豐富的分泌型免疫球蛋白和雙歧因子，具有提高動(dòng)物免疫力、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、降低動(dòng)物幼崽發(fā)病率和死亡率的作用，對(duì)于新生哺乳動(dòng)物幼崽來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。miRNA與催乳素生成途徑相關(guān)，能夠參與乳汁合成的生理過(guò)程[55]?，F(xiàn)在有超過(guò)1400種成熟的miRNA在人乳中表達(dá)[56]，人乳中還含有豐富的免疫相關(guān)miRNA[56-57]。牛乳中的一些miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)通路有關(guān)，并可能介導(dǎo)大腦發(fā)育，如miR-118-2靶向了神經(jīng)系統(tǒng)中豐富的蛋白神經(jīng)元跨膜蛋白[58]。人乳中的一些miRNA還具有組織特異性[59]，如miR-142-5p具有造血特異性[60]。人乳中miRNA還可能促進(jìn)嬰兒特定器官和組織的發(fā)育。此外，牛乳中miRNA與牛奶代謝途徑相關(guān)，如let-7家族大量存在于牛奶中，參與了葡萄糖代謝，并可調(diào)節(jié)葡萄糖耐受量和胰島素敏感性[58-59, 61]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-148a在人乳中高度表達(dá)，并且miRNA-148a在白血病中表達(dá)較少，由此可推測(cè)，母乳中miRNA-148a等miRNA可能對(duì)兒童白血病具有保護(hù)作用[62]。值得注意的是，牛乳成分(包括miRNA)的晝夜變化可能對(duì)幼畜胃腸晝夜節(jié)律性的建立和調(diào)整有益[59]。

5 展 望

眾多研究表明，miRNA與妊娠過(guò)程中的胚胎發(fā)育、妊娠疾病診斷及產(chǎn)后哺乳存在一定的關(guān)系。現(xiàn)階段miRNA參與妊娠的多數(shù)功能是通過(guò)表達(dá)模式推測(cè)的，但尚未在多數(shù)哺乳動(dòng)物中進(jìn)行細(xì)致的功能研究，并且大都是通過(guò)采取部分組織或體液進(jìn)行檢測(cè)，并不一定能完全反映其在動(dòng)物體內(nèi)的正常生理水平。若miRNA作為懷孕功能驗(yàn)證的診斷工具，其快速精確的診斷特點(diǎn)對(duì)妊娠來(lái)說(shuō)是不可或缺的，未來(lái)將miRNA應(yīng)有到妊娠診斷時(shí)要注重對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行深入探究。隨著互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)和生物學(xué)檢測(cè)手段的不斷發(fā)展，miRNA在哺乳動(dòng)物妊娠過(guò)程中的調(diào)控功能也會(huì)逐漸明晰，必將助力于畜牧與醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展。