靶向抑制高表達(dá)HRR蛋白增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性

朱佳蓓，黃 楠，崔中奇，楊慶源，潘秋輝

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，上海 200127；2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200072）

DNA雙鏈損傷（double-stranded break，DSB）是最嚴(yán)重、最難修復(fù)的DNA損傷，是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和細(xì)胞死亡的主要原因[1]。同源重組修復(fù)（homologous recombination repair，HRR）通過(guò)精確修復(fù)DSB，維持正常細(xì)胞基因組的完整性和穩(wěn)定性，是細(xì)胞發(fā)揮基本功能及維持生存的必要條件。正常細(xì)胞中HRR蛋白的缺失可導(dǎo)致基因組的嚴(yán)重不穩(wěn)定，染色體突變?cè)黾?，啟?dòng)細(xì)胞癌變[2]。放化療是臨床治療腫瘤的常用手段，其機(jī)制是通過(guò)射線、藥物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DSB，激活凋亡途徑，致使腫瘤細(xì)胞死亡[3]。有研究證實(shí)，某些HRR蛋白在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，高表達(dá)的HRR蛋白通過(guò)參與放化療導(dǎo)致的DSB修復(fù)，介導(dǎo)損傷耐受并抑制凋亡途徑，激活增殖信號(hào)通路，維持了腫瘤細(xì)胞基因組的完整性和穩(wěn)定性，使腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療耐受，得以繼續(xù)存活[4-5]。因此，這類(lèi)高表達(dá)的HRR蛋白促進(jìn)了腫瘤的形成與發(fā)展，它們有可能成為腫瘤精準(zhǔn)治療的新靶點(diǎn)。為此，本文對(duì)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的HRR蛋白如何促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展作一綜述。

1 HRR

HRR是指受損DNA以細(xì)胞內(nèi)同源染色體相對(duì)應(yīng)的序列作為模板，進(jìn)行損傷修復(fù)的過(guò)程。此過(guò)程由Nijmegen斷裂綜合征1（Nijmegen breakage syndrome 1，NBS1）-減數(shù)分裂重組蛋白11同源物A（meiotic recombination 11 homolog A，MRE11）-DNA修復(fù)蛋白50（DNA repair protein RAD50，RAD50）（簡(jiǎn)稱(chēng)MRN）復(fù)合物、乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）、乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）、重組蛋白A（recombination protein A，RecA），X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因2（X-ray repair crosscomplementing gene 2，XRCC2）等一系列關(guān)鍵的HRR蛋白協(xié)同完成。

MRN復(fù)合物是HRR的核心效應(yīng)分子，當(dāng)DSB發(fā)生后，MRN復(fù)合物可以迅速感應(yīng)損傷信號(hào)，定位于雙鏈損傷處，并將共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變激酶（ataxia-telangiectasia-mutated kinase，ATM）招募到損傷位點(diǎn)，ATM通過(guò)與MRN復(fù)合物相互作用發(fā)生自身磷酸化，形成磷酸化ATM（phosphorylated ATM，pATM）[6]。pATM可以將斷裂處的組蛋白H2AX磷酸化成γH2AX，將損傷信號(hào)放大，從而招募更多的修復(fù)蛋白如RAD51、BRCA1、BRCA2等到DSB損傷位點(diǎn)。MRN復(fù)合物和BRCA1共同參與受損DNA 5'-末端的切除，產(chǎn)生了3'-末端突出的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）[1]，復(fù)制蛋白A（replication protein A，RPA）隨后結(jié)合于ssDNA 3'-末端，RAD51在BRCA2、XRCC2等重組調(diào)節(jié)蛋白的作用下置換出RPA，并與ssDNA 3'-末端結(jié)合形成核蛋白纖維結(jié)構(gòu)。同時(shí)RAD51可尋找、識(shí)別另一段與受損DNA同源的序列，并且刺激該ssDNA侵入同源DNA雙鏈進(jìn)行配對(duì)和鏈交換，并在其他酶的作用下，完成DSB修復(fù)[2]。

2 腫瘤細(xì)胞中起癌基因功效的HRR蛋白

2.1 NBS1

NBS1基因位于人染色體8q21上，其編碼的蛋白N末端的叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域（forkhead- associated domain，F(xiàn)HA）與BRCA1 C末端結(jié)構(gòu)域（carboxylterminal domain of BRCA1，BRCT）在HRR和激活G2/M期檢查點(diǎn)中發(fā)揮重要作用[7]，能夠維持正常細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。NBS1通過(guò)其C末端區(qū)域與MRE11、RAD50形成MRN復(fù)合物，其中心區(qū)序列介導(dǎo)NBS1被ATM特異性磷酸化，從而傳遞損傷信號(hào)[1]。NBS1缺失使得RAD50、MRE11無(wú)法定位于損傷位點(diǎn)，正常細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DSB難以修復(fù)，大大提高細(xì)胞癌變的概率，因而NBS1以往被認(rèn)為是一種抑癌基因。

然而，有研究結(jié)果顯示，NBS1在非小細(xì)胞肺癌、食管癌等不同類(lèi)型的腫瘤中呈高表達(dá)。高表達(dá)的NBS1通過(guò)參與HRR維持了肺癌細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，并通過(guò)提高生長(zhǎng)因子受體下游分子磷脂酰肌醇激酶的活性，導(dǎo)致蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）磷酸化水平升高，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖、腫瘤的形成與侵襲[8]。此外，在人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的裸鼠模型中轉(zhuǎn)基因表達(dá)突變NBS1，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)下調(diào)NBS1表達(dá)干擾MRN復(fù)合物的修復(fù)功能，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，使腫瘤體積明顯縮小[9]。另外，MRN復(fù)合物抑制劑OBP-301能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[10]。

2.2 MRE11

MRE11是MRN復(fù)合物的重要組分，具有3'~5' DNA雙鏈外切酶活性、單鏈DNA內(nèi)切酶活性，其通過(guò)激活核酸外切酶1（exonuclease 1，EXO1）的5'~3' DNA雙鏈外切酶活性，參與受損DNA 5'-末端的剪切，促進(jìn)HRR過(guò)程[11]。

有研究結(jié)果顯示，MRE11的蛋白水平與乳腺癌惡性程度、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，高表達(dá)MRE11的乳腺癌細(xì)胞通過(guò)提高信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal-transducer and activator of transcription 3，STAT3）的磷酸化水平和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）水平，促使該類(lèi)細(xì)胞增殖、遷徙和侵襲；同時(shí)這類(lèi)細(xì)胞也具有較強(qiáng)的修復(fù)放療引起的DSB活力，使其在放療后得以存活，這是乳腺癌復(fù)發(fā)率增加、患者生存率下降的主要原因之一[12]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)MRE11突變?cè)鰪?qiáng)了抗腫瘤藥物胸苷和喜樹(shù)堿對(duì)結(jié)腸癌的抑制作用[13]。有研究結(jié)果顯示，MRE11的靶向抑制劑——腺病毒蛋白E4orf3和E4orf6可通過(guò)阻礙DSB修復(fù)，增強(qiáng)放療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[14]。

2.3 BRCA1

BRCA1基因位于人染色體17q21，其突變提高了患乳腺癌和卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)，因而B(niǎo)RCA1過(guò)去被認(rèn)為是一種抑癌基因[15]。BRCA1蛋白通過(guò)N末端環(huán)結(jié)構(gòu)域與BRCA1相關(guān)環(huán)狀蛋白（BRCA1-associated RING domain protein，BARD1）組成的異二聚體可以抑制腫瘤的形成[16]。BRCA1 C末端BRCT結(jié)構(gòu)介導(dǎo)了其與受體相關(guān)蛋白80（receptorassociated protein 80，RAP80）的間接結(jié)合[16]。當(dāng)DNA損傷發(fā)生后，RAP80通過(guò)參與泛素依賴(lài)的信號(hào)途徑，將BRCA1招募到DNA損傷位點(diǎn)，共同參與HRR并激活G2/M周期檢查點(diǎn)，以維持正常細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，從而阻止細(xì)胞癌變[17]。

然而，有研究結(jié)果顯示，BRCA1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)，高表達(dá)的BRCA1通過(guò)調(diào)控核糖核苷酸還原酶催化亞基的轉(zhuǎn)錄水平，保護(hù)其DNA不受內(nèi)源性復(fù)制壓力的損傷，抑制凋亡途徑，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展；而穩(wěn)定敲除腫瘤細(xì)胞中的BRCA1可以抑制抗腫瘤藥物羥基脲引發(fā)的復(fù)制叉停滯的恢復(fù)，從而促進(jìn)其凋亡[18]。此外，在胰腺癌動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)BRCA1突變能夠抑制HRR，從而加劇吉西他濱和順鉑導(dǎo)致的DSB積聚，因此靶向胰腺癌細(xì)胞中的BRCA1能夠增加該細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[19]。BRCA1的抑制劑——細(xì)胞透性蛋白-蛋白相互作用抑制劑能夠有效提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[20]。

2.4 RAP80

RAP80基因位于人染色體5q35上，其編碼蛋白的氨基端含有2個(gè)泛素相互作用模體（ubiquitin-interacting motif，UIM）。RAP80蛋白可以通過(guò)UIM基序特定識(shí)別賴(lài)氨酸第63位殘基K被泛素修飾過(guò)的γH2AX，使DNA損傷信號(hào)放大[21]。UIM結(jié)構(gòu)域也介導(dǎo)了BRCA1、RAP80、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白98（coiled-coil domaincontaining protein 98，CCDC98）、乳腺癌易感復(fù)合物亞基36（BRCA1/BRCA2-containing complex subunit 36，BRCC36）等修復(fù)蛋白復(fù)合物的形成[16]，促使RAP80招募多種修復(fù)蛋白到DNA損傷位點(diǎn)，參與HRR過(guò)程，從而維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性與復(fù)制的精準(zhǔn)性，進(jìn)而抑制細(xì)胞惡變。

但有研究結(jié)果顯示，在宮頸癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RAP80可以提高雌激素受體α（estrogen receptor alpha，ERα）蛋白水平，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[22]。此外，還有研究結(jié)果顯示RAP80在胰腺癌中呈高表達(dá)，高表達(dá)RAP80的胰腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的修復(fù)活力，能夠修復(fù)化療藥物引起的DSB，導(dǎo)致其對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性下降，而RAP80缺失的胰腺癌細(xì)胞通過(guò)調(diào)控死亡受體途徑中BCL-2相關(guān)X蛋白（BCL2-associated X，BAX）以及B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）的表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡[3]。

2.5 RAD51

RAD51是大腸埃希菌重組酶A（recombinase A，RecA）的真核細(xì)胞同源物，具有啟動(dòng)DNA同源序列的查找、配對(duì)及鏈交換的功能，是HRR不可或缺的組分[23]。

有研究結(jié)果顯示，RAD51蛋白在三陰性乳腺癌中呈高表達(dá)，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)高表達(dá)的RAD51通過(guò)促進(jìn)HRR，降低了腫瘤干細(xì)胞對(duì)聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1[poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1]抑制劑奧拉帕尼的敏感性，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)；穩(wěn)定敲除乳腺癌細(xì)胞中的RAD51后，能夠有效地減弱該類(lèi)細(xì)胞抵抗PARP1抑制劑的能力，進(jìn)而激活凋亡途徑，使腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制[24]。此外，有臨床研究證實(shí)RAD51的小分子抑制劑B02通過(guò)阻礙HRR增強(qiáng)了多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物阿霉素的敏感性[25]。

2.6 XRCC2

XRCC2基因位于人染色體7q36.1上，其編碼的蛋白是RecA RAD51亞家族的成員之一。XRCC2通過(guò)與RAD51C、RAD51D等RAD51類(lèi)似物形成復(fù)合物，聚集于復(fù)制叉及Holliday連接體，促進(jìn)RAD51介導(dǎo)的同源序列配對(duì)及鏈交換，是HRR通路中的核心成分[26-27]，因而能夠有效地減少染色體突變，從而阻止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

然而，有研究結(jié)果顯示XRCC2蛋白在直腸癌中高表達(dá)，高表達(dá)XRCC2的腫瘤細(xì)胞可以修復(fù)電離輻射引起的損傷，使腫瘤細(xì)胞在放療后存活，促進(jìn)直腸癌發(fā)展[28]。此外，有研究結(jié)果顯示，穩(wěn)定敲除XRCC2后，停滯在G2/M期的結(jié)腸癌細(xì)胞增多，同時(shí)凋亡途徑被激活，使得該類(lèi)細(xì)胞對(duì)射線更敏感，從而抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)[29]。因此，XRCC2或許可成為解決腫瘤細(xì)胞放療耐受性的潛在靶點(diǎn)。

2.7 微囊蛋白1（caveolin-1，Cav-1）

Cav-1基因位于人染色體7q31.1上， 其編碼的蛋白是細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，參與了HRR通路。當(dāng)DSB發(fā)生后，Cav-1通過(guò)抑制蛋白磷酸酶2的活性，激活由ATM磷酸化開(kāi)始的修復(fù)途徑，同時(shí)促使BRCA1在損傷位點(diǎn)的進(jìn)一步聚集[30]，在維持細(xì)胞基因組的完整性中發(fā)揮重要作用。

然而，有研究結(jié)果顯示，在Cav-1高表達(dá)的胰腺癌中，Cav-1促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷徙。通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲除胰腺癌細(xì)胞中的Cav-1后，Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）-STAT3細(xì)胞生存信號(hào)通路受阻，隨即通過(guò)活化內(nèi)源性凋亡途徑，使細(xì)胞增殖活力減弱、凋亡增加[31]。此外，胰腺癌細(xì)胞中Cav-1的表達(dá)在經(jīng)過(guò)放療后發(fā)生轉(zhuǎn)錄依賴(lài)性的上調(diào)，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞抵抗基因毒性應(yīng)激[32]，因此人工誘導(dǎo)Cav-1缺陷能有效增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。

3 腫瘤干細(xì)胞中的HRR蛋白

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中極少數(shù)具有干細(xì)胞特性，即自我更新、無(wú)限增殖、多分化潛能的細(xì)胞群[33]。有研究結(jié)果顯示，在多種腫瘤中，呈現(xiàn)干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞群HRR活性增強(qiáng)，是導(dǎo)致其抵抗放化療、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因[34]。大腸癌細(xì)胞中高表達(dá)的NBS1、RAD51D以及乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)的RAD51均介導(dǎo)了腫瘤干細(xì)胞對(duì)放化療的耐受性[24，26]。因此，通過(guò)抑制HRR蛋白可以有效地阻斷腫瘤干細(xì)胞的損傷后修復(fù)，進(jìn)一步提高腫瘤患者的放化療療效。

4 總結(jié)和展望

HRR有助于維持正常細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性與復(fù)制的精準(zhǔn)性，從而抑制腫瘤的發(fā)生?，F(xiàn)有的研究結(jié)果揭示某些HRR蛋白在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，這類(lèi)HRR蛋白在維持腫瘤細(xì)胞基因組穩(wěn)定性中同樣具有重要作用。它們通過(guò)參與放化療誘導(dǎo)DSB的修復(fù)耐受損傷，或抑制凋亡，或激活增殖相關(guān)信號(hào)通路，起到了癌基因的作用，使腫瘤細(xì)胞繼續(xù)存活，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療耐受是腫瘤治療失敗、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的主要原因，而腫瘤干細(xì)胞中高表達(dá)的這些HRR蛋白具有極強(qiáng)的HRR活力，提高了其抵抗放化療的能力。這類(lèi)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的HRR蛋白為腫瘤的精準(zhǔn)個(gè)性化治療、解決放化療耐受問(wèn)題帶來(lái)了新思路，通過(guò)藥物抑制HRR蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞在經(jīng)過(guò)放化療后DNA發(fā)生不可修復(fù)的破壞，繼而激活凋亡機(jī)制，有效地增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，從而使腫瘤細(xì)胞死亡。因此，更為透徹地了解HRR蛋白在腫瘤細(xì)胞中的作用對(duì)指導(dǎo)臨床用藥、改善腫瘤的預(yù)后等均具有重要意義。