長鏈非編碼RNA在畜禽經(jīng)濟(jì)性狀中的研究進(jìn)展

楊 兵，李曉鳳，王 昕

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100； 2. 銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，銅仁 554300)

傳統(tǒng)的基因調(diào)控研究主要是圍繞蛋白編碼基因。然而，在過去的十幾年里，隨著下一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，調(diào)節(jié)生物體復(fù)雜發(fā)育過程的主要是基因組中非編碼部分[1]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物的基因組約70%被轉(zhuǎn)錄，但只有約2%轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有編碼蛋白功能，余下約98%被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(noncoding RNAs, ncRNAs)，這意味著ncRNAs對復(fù)雜的生物體具有重要的調(diào)控作用[2-3]。ncRNA根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的長度分為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)和小非編碼RNA(microRNA)。lncRNA占ncRNA的 80%，多由RNA聚合酶II催化轉(zhuǎn)錄形成。與mRNA相比，ncRNA不具備典型的起始密碼子、啟動(dòng)子保守區(qū)、終止密碼子及開放閱讀框等[4-5]。在過去很長時(shí)間里，lncRNA被看作是“轉(zhuǎn)錄噪聲”，不被人們所重視[6]。近幾年，隨著lncRNA功能研究不斷深入，愈來愈多具有生物學(xué)功能的lncRNA相繼被證實(shí)。lncRNA能夠在染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后等水平調(diào)控基因表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)功能。研究表明，lncRNA具有諸多生物學(xué)功能，例如參與細(xì)胞增殖[7- 8]、分化[9-10]和凋亡[11-12]，促進(jìn)成肌細(xì)胞分化和損傷誘導(dǎo)的肌肉再生[13]、脂肪沉積[14]、泌乳[15]、生殖[16]和免疫[17]等生命過程。本文就lncRNA的作用機(jī)制、生物學(xué)功能以及在畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀研究中的現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨在為lncRNA在提高畜禽生產(chǎn)性能及動(dòng)物分子育種中的研究及應(yīng)用提供理論參考。

1 lncRNA的作用機(jī)制

作為近年來研究的熱點(diǎn)之一，lncRNA一般被定義為轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt、不具有編碼潛能的RNA分子[18]。根據(jù)lncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，將lncRNA大致分為正義、反義、基因內(nèi)、基因間、雙向和重疊lncRNA等幾種類型[19]。

lncRNA是基因表達(dá)的重要調(diào)控分子之一，其功能復(fù)雜多樣。根據(jù)其作用方式大致分為3類：一類是染色質(zhì)水平，通過對染色質(zhì)進(jìn)行表觀修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá)；第二類是轉(zhuǎn)錄水平，通過改變介導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)因子及酶類的功能，從而調(diào)控基因表達(dá)；第三類是轉(zhuǎn)錄后水平，通過與編碼基因或者miRNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)mRNA和miRNA的表達(dá)水平[20]。

1.1 lncRNA在染色質(zhì)水平的調(diào)控作用

細(xì)胞核來源的核糖核酸蛋白-lncRNA復(fù)合物參與染色質(zhì)修飾，從而調(diào)控某些基因表達(dá)[21-22]。例如，哺乳動(dòng)物X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄因子(lncRNAXist)控制著X染色體的失活[23]；作為一個(gè)基因間lncRNA(long intergenic noncoding RNA, lincRNA)，HOTAIR的5′端能夠與多梳蛋白抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2, PRC2)結(jié)合，3′端與LSD1/CoREST/REST復(fù)合物結(jié)合，lincRNA HOTAIR通過募集組蛋白修飾酶，介導(dǎo)特定目標(biāo)位點(diǎn)上的組蛋白修飾[24]。

1.2 lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用

lncRNA的表達(dá)水平通常與反義編碼基因或鄰近基因的表達(dá)水平有關(guān)，但表達(dá)量較低[25]。與參與染色質(zhì)修飾的蛋白相比，lncRNA不需要重新進(jìn)入核中就可發(fā)揮調(diào)控功能[26]。lncRNA可以由增強(qiáng)子元件產(chǎn)生，具有增強(qiáng)子樣的功能。產(chǎn)生的增強(qiáng)子樣lncRNA(enhancer-like RNA, eRNA)可通過染色體開放性而促進(jìn)基因的表達(dá)[27]；lncRNA還能夠作為轉(zhuǎn)錄阻遏物抑制其靶基因的表達(dá)或者作為轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[28-29]；此外，lncRNA 還可促進(jìn)染色質(zhì)修飾和重塑復(fù)合體的組裝，并協(xié)助募集到靶基因，從而激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，如linc-RAM作為一個(gè)調(diào)控因子，通過增強(qiáng)MyoD基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)MyoD-Baf60c-Brg1復(fù)合物的形成[30]。

1.3 lncRNA在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用

lncRNA能夠與其對應(yīng)的編碼基因或者miRNA結(jié)合，從而降解編碼基因的mRNA水平。Su等[31]研究了人肝癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNAHOTAIR、FOXC1基因和miR-1的關(guān)系，結(jié)果表明，HOTAIR的過表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤異種移植；FOXC1與HOTAIR的上游區(qū)域相結(jié)合，激活了lncRNAHOTAIR的表達(dá)，而且HOTAIR能夠負(fù)向調(diào)控肝癌細(xì)胞中miR-1的表達(dá)。此外，研究還表明，HOTAIR的致癌活性部分是基于miR-1的負(fù)向調(diào)節(jié)。lncRNA作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)，通過與miRNA結(jié)合而降低miRNA的活性，間接上調(diào)miRNA相關(guān)靶基因的表達(dá)，如牛肌肉組織特異性lncMD，通過競爭性吸附miR-125b，釋放對其靶基因IGF-2的抑制作用，導(dǎo)致IGF-2基因的表達(dá)水平升高，從而促進(jìn)肌肉的分化[32]。

2 lncRNA在畜禽經(jīng)濟(jì)性狀中的研究進(jìn)展

目前，關(guān)于lncRNA在畜禽經(jīng)濟(jì)性狀形成機(jī)理方面研究的熱度持續(xù)升高，從lncRNA的角度探究畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀(例如繁殖、肌肉發(fā)育、泌乳和脂肪沉積等性狀)的分子調(diào)控機(jī)制，對于提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和進(jìn)一步的育種工作具有重要的理論意義。

2.1 lncRNA在畜禽繁殖調(diào)控中的作用

已有的研究表明，lncRNA參與卵子成熟[33]、精子形成[34]、胎盤形成[35]、妊娠[36]、性腺激素應(yīng)答[37]、胚胎發(fā)育[38]和性別決定等過程[39]。郭芹芹等[40]在培養(yǎng)液中添加3 mmol·L-1谷胱甘肽研究其對牛體外受精胚胎中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加組和對照組之間差異表達(dá)的lncRNAs有59個(gè)，功能富集分析表明，這些lncRNAs參與生物黏附、生物調(diào)節(jié)、繁殖以及病毒繁殖等諸多過程。性別決定對于畜禽的某些限性性狀來說具有重要的意義，Roeszler等[41]報(bào)道，lncRNAMHM可以調(diào)控雞的胚胎發(fā)育和性腺發(fā)生，lncRNAMHM敲低可引起母雞卵巢發(fā)育不對稱以及公雞睪丸DMRT1基因表達(dá)量降低，而DMRT基因家族的主要功能是參與性別決定與分化。此外，lncRNA通過參與FOXL2基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控母山羊的性反轉(zhuǎn)，影響山羊的性別決定[42]。Caballero等[43]在牛早期胚胎lncRNA測序的基礎(chǔ)上，挑選了3個(gè)lncRNAs進(jìn)行功能研究，結(jié)果表明，敲低這3個(gè)lncRNAs后，牛成熟卵母細(xì)胞的發(fā)育速度顯著加快，囊泡顯著增大(P<0.05)。進(jìn)一步對囊泡進(jìn)行甲基化譜和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)這些lncRNAs參與了囊泡的存活，胚胎著床與母體子宮內(nèi)膜發(fā)育協(xié)調(diào)作用。Wang等[44]采用RNA-Seq 技術(shù)對懷孕第9、12和15天以及空懷期第12天約克夏母豬子宮內(nèi)膜組織lncRNA的表達(dá)模式進(jìn)行了全面分析，對各時(shí)期差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行功能富集分析表明，一些lncRNA與胚胎著床過程有關(guān)，其中l(wèi)ncRNA TCONS_01729386和TCONS_01325501在胚胎附植前可能起著至關(guān)重要的作用；各時(shí)期差異表達(dá)的基因參與了蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞過程和免疫等過程，并在焦點(diǎn)粘連、Jak2-STAT、FoxO以及MAPK信號通路中富集。可見，lncRNA在動(dòng)物的卵泡發(fā)育、妊娠及性別決定方面都具有重要的調(diào)控作用。

2.2 lncRNA在畜禽肌肉生長與發(fā)育中的作用

大量的研究表明，lncRNA調(diào)控肌細(xì)胞的細(xì)胞分化和細(xì)胞周期等過程[45-46]。在肌肉發(fā)育和分化過程中，肌源性分化因子MyoD基因是一個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄因子。Guo等[45]通過定制的微陣列技術(shù)平臺，分析了MyoD基因敲除后lncRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AK143003的表達(dá)水平與MyoD一致，該lncRNA作為負(fù)調(diào)控因子在骨骼肌細(xì)胞分化方面具有重要的作用。Xu等[46]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAH19在1周齡、1月齡、6月齡和36月齡公牛的骨骼肌中高表達(dá)，而且lncRNAH19的高表達(dá)是牛肌衛(wèi)星細(xì)胞分化所必需的。lncRNAH19的敲除引起成肌抑制基因Sirt1/FoxO1的高表達(dá)，表明H19在肌肉形成過程中抑制了Sirt1/Foxo1的表達(dá)。Yue等[47]采用高通量測序技術(shù)對牛背最長肌、肩胛部肌肉、肋間肌和臀肌的RNA表達(dá)特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)lncYYW在以上各組織中的表達(dá)量較高，而且在成肌細(xì)胞分化過程中，lncYYW的表達(dá)量逐漸增加。lncYYW的過表達(dá)增加了S期肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量，并上調(diào)了肌源性標(biāo)記—肌生成素和肌球蛋白重鏈的表達(dá)。芯片分析結(jié)果表明，lncYYW在牛成肌細(xì)胞中正向調(diào)控生長激素1(growth hormone 1, GH1)及其下游基因AKT1和PIK3CD的表達(dá)。Jin等[48]證實(shí)，過表達(dá)lnc133b能夠促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，lnc133b通過負(fù)向調(diào)控miR-133b的表達(dá)而間接調(diào)節(jié)FGFR1、PP2AC基因的表達(dá)，從而調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化。Xing等[49]為探究睪酮對豬肌肉發(fā)育的影響，對去勢和未去勢的淮南豬公豬屠宰性狀進(jìn)行了比較，并對背最長肌進(jìn)行l(wèi)ncRNA測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去勢顯著降低了眼肌面積和瘦肉率，但是脂肪量增加；測序分析發(fā)現(xiàn)，背最長肌中有8 946個(gè)lncRNAs，包括6 743個(gè)基因間lncRNAs(LincRNAs)，498個(gè)反義lncRNAs(anti-sense lncRNAs)和1 705個(gè)基因內(nèi)lncRNAs(intronic lncRNAs)。這些lncRNAs中，385個(gè)在去勢組和未去勢組間差異表達(dá)，對其靶基因的功能分析表明，主要參與了雌激素受體信號通路、骨骼肌系統(tǒng)發(fā)育和功能等。Chao等[50]對不同產(chǎn)肉性能的綿羊骨骼肌進(jìn)行l(wèi)ncRNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了39個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs，其中29個(gè)lncRNAs與肌肉發(fā)育、代謝、細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。以上的研究表明，在多個(gè)物種的肌肉發(fā)育過程中，lncRNAs參與了成肌細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等多個(gè)方面，但是其具體的調(diào)控機(jī)制仍待深入研究。

2.3 lncRNA在畜禽脂肪形成與沉積中的作用

脂肪是動(dòng)物機(jī)體的重要組成成分，對于畜禽健康及其產(chǎn)品品質(zhì)極為重要。鄭竹清等[51]利用RNA-seq技術(shù)對山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞和成熟肌內(nèi)脂肪細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNAs進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，29個(gè)lncRNAs在肌內(nèi)脂肪細(xì)胞成熟前后顯著差異表達(dá)，且這些lncRNAs在生長調(diào)節(jié)、細(xì)胞形態(tài)變化以及細(xì)胞分泌等方面發(fā)揮著重要作用。Li等[52]對體外培養(yǎng)的牛前體脂肪細(xì)胞和分化的脂肪細(xì)胞采用RNA-seq技術(shù)進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與脂肪分化相關(guān)的lncRNA(ADNCR)，該lncRNA作為競爭性內(nèi)源RNA結(jié)合miR-204而抑制成脂分化，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-204能夠靶向SIRT1基因，該研究豐富了脂肪分化的調(diào)控機(jī)制。Pang等[53]研究表明，豬前體脂肪細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PU.1 AS通過與PU.1 mRNA結(jié)合形成復(fù)合物，阻止了PU.1 mRNA的翻譯從而促進(jìn)脂肪形成。Zhang等[54]采用RNA-seq技術(shù)分析了不同分化階段的雞前體脂肪細(xì)胞lncRNAs和mRNAs的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)了1 336和1 759個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs和基因，為進(jìn)一步研究雞的脂肪細(xì)胞分化提供了依據(jù)。Yu等[55]采用RNA-seq技術(shù)對陸川豬和杜洛克豬肝、肌肉和脂肪組織的lncRNAs和mRNAs差異表達(dá)情況進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)在肝、肌肉和脂肪3個(gè)組織中特異表達(dá)的lncRNAs數(shù)量分別為386、349和336個(gè)，組織特異性表達(dá)的基因數(shù)分別為1 123、800和1 513個(gè)；對脂肪組織特異性表達(dá)的lncRNAs與脂肪相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait loci, QTL)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，275個(gè)lncRNAs位于13個(gè)脂肪相關(guān)的QTL區(qū)域，該結(jié)果為研究lncRNA調(diào)控脂肪沉積的機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。

2.4 lncRNA在畜禽毛囊生長周期及泌乳中的作用

Wang等[56]基于lncRNA、microRNA(miRNA)高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析，對陜北白絨山羊毛囊生長期和休止期差異表達(dá)的lncRNAs、mRNAs和miRNAs進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 108個(gè)lncRNAs、2 492個(gè)mRNAs和541個(gè)miRNAs在毛囊生長期和休止期差異表達(dá)。與休止期相比，1 388個(gè)基因、41個(gè)lncRNAs和15個(gè)miRNAs的表達(dá)量顯著上調(diào)，而1 104個(gè)基因、157個(gè)lncRNAs和8個(gè)miRNAs的表達(dá)量顯著下調(diào)；對差異表達(dá)lncRNAs的靶基因進(jìn)行了順式和反式作用分析，結(jié)果表明，LNC_000972、LNC_000503和LNC_000881附近有WNT3A、HOXC13等與毛囊周期相關(guān)的基因，提示lncRNA可能與鄰近基因作用調(diào)控毛囊周期。此外，還發(fā)現(xiàn)miRNA-mRNA和miRNA-lncRNA存在相互作用，因此構(gòu)建了3個(gè)內(nèi)源性競爭RNA的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：miR-221-5p-lnc_000679-WNT3、miR-34a-lnc_ 000181-GATA3和miR-214-3p-lnc_000344-SMAD3，該研究為lncRNA調(diào)控毛囊周期性發(fā)育的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

人及模式動(dòng)物相關(guān)研究已表明，lncRNA參與哺乳動(dòng)物的乳腺發(fā)育以及調(diào)控泌乳等過程[15, 57]。Zhang等[58]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)lncRNAROR可增加乳腺干細(xì)胞的自我更新，通過對其功能的進(jìn)一步研究，結(jié)果表明，lncRNAROR在維持乳腺上皮細(xì)胞正常干細(xì)胞亞群中起著關(guān)鍵作用。由于家畜上對lncRNAs研究的起步較晚，因此關(guān)于lncRNA調(diào)控母畜泌乳及乳腺發(fā)育方面的研究報(bào)道較少。近年來，Tong等[59]利用生物信息方法，從5個(gè)牛乳腺RNA-Seq數(shù)據(jù)庫中鑒定出了886個(gè)未知的基因轉(zhuǎn)錄本(UITs)。然后利用CPAT、CNCI、CPC和Hmmscan等軟件組合，預(yù)測了它們的非編碼潛力，并鑒定了184個(gè)lincRNAs。與Noncode2016數(shù)據(jù)庫和國內(nèi)動(dòng)物長鏈非編碼RNA數(shù)據(jù)庫(ALDB, http://202.200.112.245/aldb/)比對，在牛乳腺中新發(fā)現(xiàn)了112個(gè)lincRNAs，其中36個(gè)lincRNA位于與牛奶性狀相關(guān)的172個(gè)QTLs中，1個(gè)lincRNA位于臨床乳房炎的QTL區(qū)域內(nèi)。此外，他們利用LncTar預(yù)測了這些lincRNAs的潛在生物功能，并預(yù)測了10個(gè)lincRNAs的靶基因。進(jìn)一步對lincRNAs靶基因的功能分析表明，這些lincRNA參與了防御反應(yīng)、RNA磷酸二酯鍵水解、內(nèi)切核苷酸的cAMP介導(dǎo)信號、氧化還原酶分子功能、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、溶酶體細(xì)胞組成部分等信號通路，該研究為lincRNA調(diào)控奶牛乳腺發(fā)育及對乳腺炎易感性的生物學(xué)功能提供了依據(jù)。

另外，lncRNA在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此lncRNA已成為疾病診斷和治療的潛在生物標(biāo)記和靶標(biāo)[60]。Ma等[61]采用牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)感染Madin-Darby牛腎細(xì)胞系的方法，探究宿主抵抗牛病毒性腹瀉病毒、牛病毒性腹瀉病毒感染宿主的機(jī)制。他們選取感染后2、6和18 h的牛腎細(xì)胞系進(jìn)行高通量測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了1 236 個(gè)差異表達(dá)的lncRNAs和3 261個(gè)差異表達(dá)mRNAs。lncRNA靶基因的功能分析結(jié)果表明，這些基因聚集于MHC I類生物合成過程、正向調(diào)控肽類蛋白、自然殺傷細(xì)胞激活以及干擾素/β-受體結(jié)合分子等生物過程，提示在BVDV感染過程中，這些lncRNA參與調(diào)控牛的免疫反應(yīng)。

3 展 望

目前，lncRNAs在畜牧學(xué)科中的研究仍處于研究起步階段，主要局限于發(fā)現(xiàn)和鑒定特定組織或發(fā)育階段的lcnRNAs。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)、新一代測序技術(shù)以及生物信息分析技術(shù)的快速發(fā)展，將會(huì)有更多新的lncRNAs在畜禽研究中被發(fā)現(xiàn)，用于指導(dǎo)畜禽生產(chǎn)實(shí)踐、經(jīng)濟(jì)性狀改良、疾病防控以及治療等方面。但是如何更系統(tǒng)地、具體地研究lncRNAs在畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀中的功能是接下來幾年甚至十幾年畜牧工作者需要解決的問題。