牛氣腫疽的病原學(xué)診斷方法

田 苗

（遼寧省鞍山市岫巖滿族自治縣動物疫病預(yù)防控制中心， 遼寧 鞍山114300）

牛氣腫疽，病原是氣腫疽梭菌，可經(jīng)消化道直接感染，創(chuàng)傷的皮膚也可引發(fā)感染。病牛及其排泄物和其污染的飼料、飲水、土壤都是傳染源，可引起病牛高熱、跛行，胸頸部、大腿等身體肌肉豐滿部位出現(xiàn)氣性炎癥腫脹，指壓患部有捻發(fā)音。嚴(yán)重病牛食欲廢絕，反芻停止，體溫下降，呼吸困難，直致死亡。本病發(fā)病急，病程短，危害嚴(yán)重，所以在短時間內(nèi)準(zhǔn)確診斷顯得尤為重要。

牛氣腫疽病雖然可根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀及病理學(xué)變化等做出初步診斷，但確診須經(jīng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原分離培養(yǎng)等一系列工作。

1 病料采集和處理

氣腫疽多為敗血癥，故可采取血液或任何臟器，且宜采取管骨，既便于保存運(yùn)送，又不易污染。在無菌條件下采取剛剛死亡（夏日2～4h，冬日12h內(nèi)）病牛的且有病變的肌肉小塊，約10cm3大小，浸于溶解后的石蠟液中，蠟?zāi)毯?，即取出用塑料紙包運(yùn)，與此同時制備血液、臟器、肌肉、滲出物涂片，以備染色鏡檢。疑為此菌時要作肝表面觸片。

2 細(xì)菌學(xué)檢查

血液或組織涂片，可見大桿菌、無莢膜、芽孢比菌體大，位于中央或偏端，革蘭氏染色陽性。若為炭疽桿菌則有莢膜而不見芽孢。肝表面觸片為單個或短鏈，不呈長絲狀。如為腐敗梭菌，則肝表面觸片可呈長絲狀。但僅以涂片或觸片尚不能作最后的確診。

3 病原分離及鑒定

將肝、肌肉或骨髓等接種于葡萄糖鮮血平皿或鮮血平皿（厭氧培養(yǎng)）或熟（庖）肉基中，1～2d，此菌在平皿上長出圓形、邊緣有時不太整齊、紐扣狀菌落，或中心凸起，或有同心圓，菌落直徑達(dá)2～4mm，周圍有β溶血環(huán)。幼年培養(yǎng)物涂片染色呈革蘭氏陽性。必要時也可取小塊肌肉，移植于肝塊肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)24h后再重復(fù)接種于葡萄糖鮮血瓊脂平板上，反復(fù)操作至獲得純培養(yǎng)為止。

4 動物試驗(yàn)

接種病料肌肉乳劑或培養(yǎng)物0.5～1mL，肌肉注射于豚鼠。接種后豚鼠常在24～48h內(nèi)死亡。注射動物可測細(xì)菌毒力，亦可將死亡豚鼠的肌肉、肝臟制片鏡檢及作細(xì)菌的分離培養(yǎng)鑒定。

5 分離物的鑒定

5.1 細(xì)菌形態(tài)及染色特性 氣腫疽梭菌是有芽孢兩端鈍圓的粗大桿菌，1.3～3.4μm×0.5～0.8μm，在病料中一般為直形，單個或成對排列。無莢膜，周身鞭毛，運(yùn)動活潑。芽孢不僅在動物體外形成，患病牛的肌肉與滲出液中亦有。芽孢為卵圓形，位于菌體中央或近端，可比菌體大，使帶芽孢的菌體呈紡錘狀或湯匙狀。在陳舊的培養(yǎng)物中可見到復(fù)數(shù)游離的卵圓形芽孢。本菌為各種苯胺染料著色，病料與幼齡培養(yǎng)物中的菌體為革蘭氏陽性。而老齡培養(yǎng)菌大部分為陰性。5.2 生長及生化特性

本菌厭氧，發(fā)育適溫為37℃，pH為7.2～7.4，在適宜培養(yǎng)基中24h即生長。在葡萄糖鮮血瓊脂上為圓形、平坦，中心隆起似紐扣狀菌落，周圍有微弱的β溶血環(huán)。在瓊脂上為邊緣不整齊的菌落，大小為2～3mm，呈淡藍(lán)色。在深層葡萄糖瓊脂中發(fā)育成細(xì)弱突起的球形或扁豆形的小菌落。移植于肉肝湯經(jīng)12～24h呈均等混濁并產(chǎn)氣，至24～48h，上液清亮，管底有松散的白色沉淀。熟肉基中表現(xiàn)為分解糖型。于腦培養(yǎng)基中發(fā)育良好，但不變黑。將菌落鉤取移植于熟肉基中，作生化試驗(yàn)，其生化特性為：發(fā)酵葡萄糖、單奶糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。不發(fā)酵鼠李糖、菊糖、衛(wèi)矛醇、水楊素（苷）、甘油或甘露醇，還原硝酸鹽，產(chǎn)硫化氫，石蕊牛奶有時無變化，有時微產(chǎn)酸，據(jù)此可做出確診。

5.3 毒素檢查

本菌在厭氣肝湯或熟肉基中培養(yǎng)可產(chǎn)生 α、β、γ、δ 四種外毒素。α毒素即是耐氧的溶血素，能溶解牛的紅細(xì)胞，α毒素還是神經(jīng)毒素，能引起皮膚壞死和纖維蛋白溶解；β毒素是脫氧核糖核酸；γ毒素是透明質(zhì)酸酶；δ毒素是不耐氧的溶血素。這四種毒素不耐熱，在52℃下30min可被破壞；在室溫下放置24～48h毒性明顯下降。用外毒素靜脈注射小鼠或豚鼠可致死，但家兔有明顯的抵抗力。

α毒素可用其對小鼠致死測定。β毒素可用影響白細(xì)胞著色法來檢查。影響白細(xì)胞著色法：系用家兔血液涂片，在空氣中干燥，用甲醇固定，將涂片的一半浸于用生理鹽水2倍稀釋的細(xì)菌培養(yǎng)濾液中，另一半作為對照；同時用生理鹽水代替細(xì)菌培養(yǎng)液同法操作，作為生理鹽水對照。玻片直立于培養(yǎng)液或鹽水中置38℃水浴中18h，取出用蒸餾水沖洗，血片染色（瑞氏或姬姆薩法）鏡檢，白細(xì)胞染色淺并現(xiàn)空殼為陽性，有本毒素存在。毒素濃度高時，可看到?jīng)]有著色的白細(xì)胞，紅細(xì)胞不受影響。使50%白細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重破壞的濾液稀釋度為毒素滴度，與一單位抗毒素血清混合后，仍能破壞片中50%白細(xì)胞的最小細(xì)菌培養(yǎng)濾液量，為1個毒素單位。γ毒素可用酸剛果紅乙醇（ACRA）法測定。δ毒素可用溶血法測定。但因其不耐氧，在測定過程中，需用適宜的還原劑，如巰基乙酸鈉達(dá)0.05%～0.1%，以避免毒素受氧的作用而被滅活，不能測定。