對綿羊結(jié)核病病原體的研究

姜德相，王立文，董桂紅

（吉林省畜牧業(yè)學(xué)校，吉林 白城 137000）

以往認為綿羊?qū)Y(jié)核病原體易感性差，臨床病歷不常見，很少有人報道和進行深入研究。由于近些年養(yǎng)羊業(yè)特別是育肥羊行業(yè)的興起，飼養(yǎng)規(guī)模和密度增大使結(jié)核病在羊群中進行傳播，同時還威脅著人類的身心健康。作者通過臨床解剖收集27只具有典型病理變化的病歷進行歸納總結(jié)，希望能夠認清結(jié)核病在綿羊群中的流行情況并對結(jié)核病防治提供幫助。

1 綿羊結(jié)核病的實驗室診斷和病原體類型

目前，按結(jié)核病病原體對易感動物的易感性，將其分為人型、牛型和禽型。關(guān)于綿羊結(jié)核病病原體沒有具體表述，作者把近5年來自不同飼養(yǎng)場臨床送檢的27只病理變化典型的實驗動物進行實驗室診斷和分型。

1.1 實驗室診斷

1.1.1 直接厚涂片法

（1）制片 取疑似結(jié)核結(jié)節(jié)內(nèi)的干酪樣、膿樣標本0.05～0.1g，放于玻片中央，涂成20mm×25mm橢圓形，取不同結(jié)核結(jié)節(jié)至少涂2張片子，進行微火固定。其中有化膿性腹膜炎的病歷，取膿樣標本也同時進行檢測。

（2）染色 滴加5%石炭酸復(fù)紅液于玻片上，加溫至有蒸汽出現(xiàn)后放置5～10min，水洗。之后，加5%鹽酸酒精脫色數(shù)次，至淡紅色為止，水洗，加美蘭復(fù)染2～3min，水洗，自然干燥后鏡檢。

（3）鏡檢及報告 鏡檢至少檢查100個視野，不得少于3～4min，未找到抗酸菌者為Z（-）。100個視野找到抗酸菌1～2條者，實報菌數(shù)。100個視野找到抗酸菌3～9條者報O（+）。100個視野找到抗酸菌10～39條者報T（++）。每個視野找到抗酸菌～10條者報N（+++）。每個視野找到抗酸菌10條以上者報 M（++++）。

（4）統(tǒng)計結(jié)果 以時間先后排序（干：代表干酪物，膿：代表膿汁）見表1。

（5）結(jié)果 27只臨床病理變化典型病例，檢出陽性率達77.8%，可見綿羊?qū)Y(jié)核病的病原體易感性較強。

1.1.2 分離培養(yǎng)

（1）培養(yǎng)基 常用于結(jié)核桿菌的分離培養(yǎng)基有改良羅氏培養(yǎng)基、酸性改良羅氏培養(yǎng)基、丙酮酸培養(yǎng)基和小川培養(yǎng)基。

（2）病料預(yù)處理法 酸處理法：此法適用改良羅氏培養(yǎng)基和丙酮酸培養(yǎng)基。取痰液標本或其它標本（剪碎后研磨）加2～4倍量4%硫酸液，室溫處理20min，其間振蕩2～3次，促進液化。堿處理法：取標本加2～4倍量的2%NaOH溶液，37℃處理30min。此法適用于酸性改良羅氏培養(yǎng)基和小川培養(yǎng)基。

（3）接種 取混勻的消化的病料液0.1mL，均勻地接種于培養(yǎng)基斜面上，每份標本至少接種兩管。接種后，將試管斜放，1d后，豎立直于試管架上。也可以將消化的病料離心后，取沉淀接種效果更好。

（4）結(jié)果判定 接種后置37℃培養(yǎng)，每周觀察一次，陽性者隨時報告，陰性者在8周時報告之。陽性者報告抗酸菌培養(yǎng)陽性或以菌落數(shù)報告。菌落數(shù)占據(jù)培養(yǎng)基面1/4以下者為（+）；菌落數(shù)占據(jù)培養(yǎng)基面1/4以上，1/2以下者為（++）；菌落數(shù)占據(jù)培養(yǎng)基面1/2以上、3/4以下者為（+++）；菌落數(shù)占據(jù)全斜面者為（++++）。陰性者報告抗酸性菌培養(yǎng)陰性。

表1 涂片鏡檢結(jié)果

表2 菌型鑒定

根據(jù)結(jié)核分枝桿菌和其他分枝桿菌的鑒別依據(jù)：結(jié)核分枝桿菌（L－J：+ PNB：－ T2H：+），牛分枝桿菌（L－J：+ PNB：－ T2H：－），其他分枝桿菌（L－J：+ PNB：+ T2H：+）。

1.2 菌型鑒定

分離出抗酸性菌后，為了確定是哪一個型的分枝桿菌，則必須進一步進行鑒定。

鑒定培養(yǎng)基：改良羅氏培養(yǎng)基（L－J）。對氨基苯甲酸培養(yǎng)基（PNB），按0.5mg/mL（最終濃度）的PNB加入小川培養(yǎng)基。噻吩二羧酸酰肼培養(yǎng)基（T2H），取T2H 50mg，加入蒸餾水100mL中，使成為500μg/mL，取其1mL加入小川培養(yǎng)基中，混勻分裝，凝固滅菌，最終濃度5μg/mL。

將21個陽性菌株制成懸液，按濕菌10μm重接種于鑒定培養(yǎng)基。觀察結(jié)果見表2。

經(jīng)過鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后的結(jié)果和其他分枝桿菌鑒別對照，發(fā)現(xiàn)21個結(jié)核陽性病歷均為牛型分枝桿菌感染，因為這些病歷是來自不同時間，歷時5年，又來自不同地區(qū)和不同飼養(yǎng)場搜集，整理，經(jīng)過實驗獲得，可以說明綿羊的結(jié)核病基本上都是由牛型分枝桿菌的病原體感染造成的。

1.3 展望

加強對綿羊結(jié)核病調(diào)查和研究，摸清病原的特點，探索病原的流行和演化規(guī)律，制定相應(yīng)的防治方法；加強對綿羊結(jié)核病耐藥機制的研究，研制新型抗結(jié)核藥物和新型疫苗。

隨著綿羊結(jié)核病檢測水平的不斷提高、預(yù)警預(yù)報監(jiān)測體系的不斷完善和牛分枝桿菌功能基因組研究的深入，必將為綿羊結(jié)核病的防治帶來更多的機遇，但也面臨著巨大的挑戰(zhàn)，對綿羊結(jié)核病的研究仍然是任重而道遠。