木犀草素對巨噬細(xì)胞炎癥極化的影響及機(jī)制

王書俠，姚孝明，葛亮，吉寧，蔣葉，曹萌

嚴(yán)重病原感染導(dǎo)致的膿毒癥病情危急，發(fā)展迅速，部分將發(fā)展為多臟器功能衰竭，甚至危及生命。此過程往往伴隨重度炎癥反應(yīng)的發(fā)生，過度的炎癥反應(yīng)又會造成病理損傷，因此炎癥的精確調(diào)控至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞是觸發(fā)炎癥反應(yīng)的重要免疫細(xì)胞，根據(jù)所處微環(huán)境不同，可被誘導(dǎo)分化為致炎型(M1)巨噬細(xì)胞或抗炎型(M2)巨噬細(xì)胞[1]。巨噬細(xì)胞的不同極化方式，決定了該細(xì)胞在炎癥的發(fā)生、發(fā)展和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)等方面所發(fā)揮的重要作用[2]。調(diào)控膿毒癥時(shí)巨噬細(xì)胞的極化對控制疾病的轉(zhuǎn)歸具有十分重要的意義。木犀草素(luteolin, lut，L)屬于天然黃酮類化合物，主要存在于蔬果和中草藥中，具有很強(qiáng)的生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗感染、免疫調(diào)理、保護(hù)心臟等[3-5]。有研究表明，木犀草素能顯著減輕活化的巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)，下調(diào)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等致炎因子的表達(dá)，但木犀草素是否影響巨噬細(xì)胞的炎癥極化，目前還未見報(bào)道[6]。本研究通過脂多糖(LPS)聯(lián)合γ-干擾素(IFN-γ)刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞，研究木犀草素對其炎癥分子的表達(dá)及極化表型的影響，以探討木犀草素調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 RAW264.7巨噬細(xì)胞來源于小鼠腹腔，為南京中醫(yī)藥大學(xué)惠贈；LPS、MTT和木犀草素購自美國Sigma公司；IL-4購自美國PeproTech公司；抗體磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transduction，p-STAT)3和p-STAT6購自美國CST公司；IFN-γ購自美國R&D公司；β-actin一抗購自美國Santa Cruz公司；Antimouse CD86 FITC、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本Toyobo公司。流式細(xì)胞儀購自Millipore公司；Quant studio DX realtime-qPCR儀購自美國Applied Biosystemsby Life Technologies公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo) RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5%CO2、37℃的孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。10ng/ml LPS和20ng/ml IFN-γ刺激誘導(dǎo)其致炎型M1極化；20ng/ml的IL-4刺激誘導(dǎo)抗炎型M2極化。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)期生長的細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，鋪96孔板后過夜培養(yǎng)。采用LPS和IFN-γ刺激細(xì)胞誘導(dǎo)M1型極化，IL-4刺激誘導(dǎo)M2型極化，同時(shí)M1細(xì)胞用終濃度為5、10、20、40、80μmol/L的木犀草素處理，24h后，每孔加MTT(5g/L，PBS)20μl，4h后吸棄上清，每孔加DMSO 150μl，待結(jié)晶物完全溶解后，測定吸光度(OD值)，計(jì)算生長率。生長率＝(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)MTT結(jié)果將實(shí)驗(yàn)分為6組。對照組(control組)：不加藥物；M1組：采用LPS和IFN-γ刺激；M2組：采用IL-4刺激；M1+5L組、M1+10L組和M1+20L組在加LPS和IFN-γ的基礎(chǔ)上分別再加終濃度為5、10、20μmol/L的木犀草素。24h后收集細(xì)胞。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR(real-time qPCR)檢測M1和M2型標(biāo)志分子mRNA水平 檢測細(xì)胞的處理法同上，細(xì)胞處理后過夜，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書，Trizol法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，熒光定量PCR擴(kuò)增一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β、IL-6、精氨酸酶1(Arginase 1，Arg1)、CD206、CD163等基因，以GAPDH為內(nèi)參照，目的基因相對表達(dá)量采用2–ΔΔCt法。

1.6 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 冷的PBS洗滌細(xì)胞，放射免疫沉淀法(RIPA)并加入蛋白酶抑制劑(PMSF)裂解提取總蛋白，參照BCA試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。20μg蛋白煮沸后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2h。加入一抗4℃過夜，洗膜3次，加入二抗，室溫?fù)u床2h，洗膜4次，ECL顯影，掃描膠片并保存。用Quantity One軟件分析灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，并計(jì)算與β-actin的比值。

1.7 ELISA檢測上清細(xì)胞因子含量 細(xì)胞按每孔2×105個(gè)/ml的密度鋪板，過夜培養(yǎng)后，LPS和IFN-γ或IL-4誘導(dǎo)極化。然后加入不同劑量的木犀草素，實(shí)驗(yàn)分組同1.4。24h后，收集上清，檢測IL-6和TNF-α的水平，具體操作依據(jù)ELISA試劑盒檢測說明書。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析和Tukey post-hoc檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 木犀草素對細(xì)胞活力的影響 MTT結(jié)果顯示，M2組細(xì)胞的相對活性(95.75±3.16)與對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。M1組細(xì)胞活性(72.24±5.10)與對照組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)木犀草素濃度達(dá)到40μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性(42.78±4.61)開始降低，與M1組(72.24±5.10)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。故本實(shí)驗(yàn)選擇木犀草素5、10和20μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。

圖1 木犀草素對活化的 RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of luteolin on the vitality of activated RAW264.7 macrophages

2.2 木犀草素對M1和M2型標(biāo)志分子表達(dá)的影響從qPCR結(jié)果可見，LPS和IFN-γ刺激RAW264.7細(xì)胞導(dǎo)致M1型標(biāo)志分子iNOS、IL-1β和IL-6的相對表達(dá)明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01；P＜0.001，表1)，表明誘導(dǎo)其向M1型極化。IL-4刺激RAW264.7細(xì)胞導(dǎo)致M2型標(biāo)志分子Arg1、CD206和CD163的相對表達(dá)明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05；P＜0.01)，表明誘導(dǎo)其向M2型極化。5、10、20μmol/L的木犀草素干預(yù)M1細(xì)胞后，M1型炎性因子的表達(dá)明顯下調(diào)，與M1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05；P＜0.01)；而木犀草素處理后的M2型標(biāo)志分子的表達(dá)明顯上調(diào)，且呈濃度依賴性，與M1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

表1 木犀草素對M1型標(biāo)志分子iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA相對表達(dá)的影響(±s，n=3)Tab.1 Effects of luteolin on the relative expressions of M1 marker molecules iNOS, IL-1β and IL-6 mRNA (±s, n=3)

表1 木犀草素對M1型標(biāo)志分子iNOS、IL-1β和IL-6 mRNA相對表達(dá)的影響(±s，n=3)Tab.1 Effects of luteolin on the relative expressions of M1 marker molecules iNOS, IL-1β and IL-6 mRNA (±s, n=3)

iNOS.Inducible nitric oxide synthase; IL.Interleukin; (1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.001 compared with control group; (3)P＜0.05 compared with M1 group; (4)P＜0.01 compared with M1 group

Group iNOS IL-1β IL-6 Control 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 M1 98.91±10.65(1) 110.69±4.12(1) 394.10±33.47(2)M2 0.54±0.08 2.13±0.35 1.99±0.07 M1+5L 95.45±1.64(3) 103.14±2.58(3) 177.51±19.28(3)M1+10L 92.73±16.96(3) 78.38±8.65(3) 106.14±5.63(3)M1+20L 29.52±3.07(3) 41.59±6.80(3) 27.15±1.26(4)

表2 木犀草素對M2型標(biāo)志分子Arg1、CD206和CD163 mRNA相對表達(dá)的影響(±s，n=3)Tab.2 Effects of luteolin on the relative expressions of M2 marker molecules Arg1, CD206 and CD163mRNA (±s, n=3)

表2 木犀草素對M2型標(biāo)志分子Arg1、CD206和CD163 mRNA相對表達(dá)的影響(±s，n=3)Tab.2 Effects of luteolin on the relative expressions of M2 marker molecules Arg1, CD206 and CD163mRNA (±s, n=3)

Arg1.Arginase 1; (1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.01 compared with control group; (3)P＜0.05 compared with M1 group

Group Arg1 CD206 CD163 Control 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 M1 1.61±0.50 0.68±0.19 0.41±0.14 M2 16.72±2.51(2) 6.13±0.09(1) 3.79±0.77(1)M1+5L 3.22±1.44(3) 1.21±0.44(3) 0.62±0.39(3)M1+10L 4.99±0.99(3) 1.70±0.53(3) 1.38±0.40(3)M1+20L 7.63±2.33(3) 4.23±1.71(3) 2.06±0.12(3)

2.3 木犀草素對極化的細(xì)胞表面分化群CD86的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，LPS和IFN-γ誘導(dǎo)成的M1細(xì)胞表面分化群CD86的平均熒光強(qiáng)度(127.23%)增強(qiáng)，表明CD86的表達(dá)上調(diào)，相對于對照組(27.6%)，峰明顯右移。而IL-4誘導(dǎo)成的M2細(xì)胞CD86的平均熒光強(qiáng)度(26.18%)減弱，表明CD86的表達(dá)下調(diào)，峰左移，與對照組的曲線幾乎重疊。在加入不同濃度的木犀草素后，M1細(xì)胞表達(dá)的CD86的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，在木犀草素濃度為20μmol/L時(shí)，CD86的熒光強(qiáng)度低至44.38%，較木犀草素濃度為10μmol/L時(shí)的72.23%明顯下降，峰明顯左移(圖2)。

圖2 木犀草素對極化的細(xì)胞CD86表達(dá)的影響Fig.2 Effects of luteolin on CD86 expression in polarized cells

2.4 木犀草素對活化的細(xì)胞分泌炎癥因子的影響M1組細(xì)胞分泌的IL-6和TNF-α與對照組比較明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。經(jīng)木犀草素處理后，細(xì)胞因子的分泌減少，與M1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。M2組細(xì)胞分泌的IL-6和TNF-α與M1組比較明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.001)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表3)。

表3 木犀草素對活化的細(xì)胞IL-6和TNF-α分泌的影響(pg/ml, ±s, n=3)Tab.3 Effects of luteolin on IL-6 and TNF-α secretion in activated cells (pg/ml, ±s, n=3)

表3 木犀草素對活化的細(xì)胞IL-6和TNF-α分泌的影響(pg/ml, ±s, n=3)Tab.3 Effects of luteolin on IL-6 and TNF-α secretion in activated cells (pg/ml, ±s, n=3)

IL.Interleukin; TNF-α.Tumor necrosis factor-α; (1)P＜0.001,(2)P＜0.01 compared with control group; (3)P＜0.001, (4)P＜0.01, (5)P＜0.05 compared with M1 group

Group IL-6 TNF-α Control 35.21±5.00 320.12±28.28 M1 3203.33±221.04(1) 2004.25±39.59(2)M2 68.34±2.83(3) 348.16±42.22(4)M1+5L 2257.61±61.38(5) 1608.02±22.63(5)M1+10L 516.63±18.78(4) 78.38±8.65(5)M1+20L 87.26±8.46(3) 366.20±36.66(4)

2.5 木犀草素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞源性M1表型向M2表型極化的機(jī)制 STAT信號通路的活化參與巨噬細(xì)胞極化表型的調(diào)控。LPS和IFN-γ誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞M1極化，p-STAT3上調(diào)、p-STAT6下調(diào)。而IL-4誘導(dǎo)的細(xì)胞M2極化，p-STAT6上調(diào)、p-STAT3下調(diào)。木犀草素處理后，M1源性的p-STAT3逐漸下調(diào)，而p-STAT6逐漸上調(diào)，并具有濃度依賴性(圖3)。

圖3 木犀草素對活化的細(xì)胞p-STAT蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of luteolin on p-STAT protein expression in activated macrophages

3 討 論

膿毒癥時(shí)活化的巨噬細(xì)胞分泌大量的致炎因子，過量的致炎因子打亂了機(jī)體的穩(wěn)態(tài)平衡，引起一些炎癥相關(guān)疾病，如腫瘤、感染、腎病、動脈粥樣硬化、2型糖尿病等[7-9]。鑒于巨噬細(xì)胞感知微環(huán)境的不同而極化為不同的表型，即在LPS等因子的刺激下分化成致炎癥損傷的M1型和在IL-4或IL-13等誘導(dǎo)下參與炎癥修復(fù)的M2型，如M1型活化，則損傷占優(yōu)勢，炎癥加重；如M2型活化，則抗炎和組織修復(fù)反應(yīng)為主導(dǎo)，則炎癥趨向好轉(zhuǎn)。因此調(diào)控巨噬細(xì)胞功能表型對治療炎癥性疾病具有非常重要意義。本研究通過黃酮類化合物木犀草素對活化的小鼠RAW264.7炎癥因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，探討木犀草素對巨噬細(xì)胞極化的影響及可能的機(jī)制，為天然抗炎藥的開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS聯(lián)合IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞被活化致敏，形態(tài)發(fā)生明顯變化，M1型炎癥介質(zhì)iNOS、IL-1β、IL-6等表達(dá)上調(diào)；IL-4誘導(dǎo)的M2型抗炎因子Arg1、CD206和CD163表達(dá)上調(diào)，表明巨噬細(xì)胞的炎癥模型誘導(dǎo)成功。木犀草素處理后，M1極化的RAW264.7細(xì)胞表達(dá)的致炎因子下調(diào)，抗炎分子上調(diào)，同時(shí)M1細(xì)胞上清分泌的IL-6和TNF-α明顯降低，說明木犀草素能抑制致炎因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎分子的表達(dá)，誘導(dǎo)致炎型的M1細(xì)胞向抗炎型的M2細(xì)胞極化。

在巨噬細(xì)胞的極化過程中，涉及許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，其中STATs的活化占有舉足輕重的地位，活化的STAT3和STAT6參與多種致炎和抗炎因子的調(diào)控。Yu等[10]報(bào)道，白花前胡素可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-6的表達(dá)和STAT3蛋白通路的激活，并且IL-6的表達(dá)與STAT3蛋白的活化相關(guān)。Chen等[11]發(fā)現(xiàn)，酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interacting protein-1，CKIP-1)能通過下調(diào)STAT6而抑制M2表型的極化。條班紫菜糖蛋白能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞從M1向M2的轉(zhuǎn)化，這個(gè)過程有STAT3和STAT6通路的參與[12]，可見STAT3和STAT6的激活在M1型和M2型的表型極化過程中發(fā)揮舉足輕重的作用。本研究發(fā)現(xiàn)LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的M1極化細(xì)胞p-STAT3表達(dá)增強(qiáng)，致炎介質(zhì)上調(diào)，IL-4誘導(dǎo)的M2極化細(xì)胞p-STAT6表達(dá)增強(qiáng)，抗炎介質(zhì)下調(diào)。木犀草素處理后，M1極化的細(xì)胞p-STAT3水平明顯減少，致炎因子下調(diào)，而p-STAT6的水平明顯增多，抗炎因子上調(diào)，表明木犀草素調(diào)節(jié)RAW264.7細(xì)胞M2極化的過程是通過抑制p-STAT3、上調(diào)p-STAT6而實(shí)現(xiàn)的。

本研究中，我們以LPS和IFN-γ協(xié)同刺激RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)M1極化，釋放炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1β和TNF-α等。IL-6和IL-1β為炎癥早期的重要標(biāo)志物，同時(shí)，IL-6還與自身免疫病及腫瘤的侵襲及耐藥相關(guān)[13-14]。TNF-α在炎癥的急性期大量產(chǎn)生，能引起發(fā)熱反應(yīng)。有研究表明，LPS不能直接活化STAT3，但M1細(xì)胞釋放的IL-6和IFN-γ等能間接激活STAT3，活化的STAT3進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS等炎癥因子的表達(dá)，這些因子之間形成嚴(yán)格的網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致致炎因子的異常分泌，引起組織壞死和膿毒性休克[15-16]。本研究表明，木犀草素有力地抑制了M1細(xì)胞p-STAT3的表達(dá)，調(diào)節(jié)致炎因子在合適的水平。

與STAT3不同，STAT6能刺激巨噬細(xì)胞向M2型極化，活化的STAT6可以調(diào)節(jié)抗炎因子的表達(dá)，如Arg1、CD206、CD63等，STAT6的缺失還會誘發(fā)自身免疫病[17-18]。Arg1可與iNOS競爭底物L(fēng)-精氨酸，不僅能減少iNOS所生成的一氧化氮(NO)對機(jī)體的損傷，還能分解精氨酸促進(jìn)組織的修復(fù)[19]。CD206和CD163，均為M2型細(xì)胞膜表面的標(biāo)志分子，參與抗炎、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)理等[20-22]。IL-4能通過STAT6的活化介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化，上調(diào)抗炎因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞STAT6表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)，木犀草素處理的M1細(xì)胞STAT6表達(dá)增強(qiáng)，抗炎因子逐漸上調(diào)，表明木犀草素通過p-STAT6通路誘導(dǎo)M1細(xì)胞向M2型極化，釋放抗炎因子，減輕炎癥損傷。

木犀草素作為一種可食用的黃酮，存在于多種蔬果和中草藥中，具有抗氧化、抗炎和清除自由基等作用。目前，抗炎免疫中藥的機(jī)制研究多集中于抑制炎性介質(zhì)的釋放和核轉(zhuǎn)錄因子的活性等，尋找中藥來源的巨噬細(xì)胞表型調(diào)控劑勢在必行[23]。中藥木犀草素為天然抗炎免疫藥，具有多效調(diào)節(jié)、不良反應(yīng)輕和易于耐受等特點(diǎn)[24]。我們的前期研究結(jié)果顯示，木犀草素可以抑制活化的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放，但木犀草素是否能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的極化還不明確[6]。本研究結(jié)果顯示，木犀草素可明顯抑制M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，促進(jìn)M2型標(biāo)志物的表達(dá)，調(diào)節(jié)致炎型M1巨噬細(xì)胞極化為抗炎抗損傷作用的M2型巨噬細(xì)胞，此功效可能是通過抑制p-STAT3、激活p-STAT6而實(shí)現(xiàn)的。上述木犀草素對巨噬細(xì)胞極化的影響及調(diào)控機(jī)制，將為臨床治療炎癥相關(guān)性疾病提供新的思路。