趨化因子CCL2對(duì)血小板內(nèi)p38MAPK-HSP27通路的活化作用

曹禹，喬銳，劉丹，李春輝，于淼

在冠心病進(jìn)展的過(guò)程中，如果血小板在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊形成及不穩(wěn)定斑塊破裂部位觸發(fā)聚集反應(yīng)，會(huì)引起血栓栓塞，同時(shí)還可引起持續(xù)的AS炎癥反應(yīng)及微循環(huán)障礙。血小板的持續(xù)活化與急性冠脈事件互為因果[1]，活化后的血小板在血栓性血管閉塞中發(fā)揮著重要作用，并同時(shí)參與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)發(fā)展進(jìn)程中相關(guān)微小血栓的形成、血管收縮、斑塊進(jìn)展、炎癥反應(yīng)等過(guò)程。斑塊內(nèi)的血小板可釋放多種生長(zhǎng)因子和趨化因子進(jìn)入微環(huán)境，促進(jìn)斑塊進(jìn)展[2]。不斷發(fā)展的炎癥反應(yīng)或斑塊破裂所致的冠脈栓塞與臨床預(yù)后密切相關(guān)[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ST抬高型心肌梗死(ST-elevation myocardial infarction，STEMI)患者服用替格瑞洛后仍存在一定程度的殘余血小板活化，血小板高反應(yīng)患者血漿及血小板內(nèi)趨化因子CCL2表達(dá)較血小板正常反應(yīng)患者高。殘余血小板聚集率也與血漿中CCL2的表達(dá)，提示CCL2參與了血小板的聚集和活化，且與患者預(yù)后相關(guān)[4]。然而，CCL2調(diào)控血小板活化的具體機(jī)制尚未明確，本研究應(yīng)用蛋白芯片篩選經(jīng)CCL2因子刺激后人血小板內(nèi)發(fā)生磷酸化的激酶，比較野生型C57小鼠與CCL2–/–小鼠血小板內(nèi)相關(guān)激酶的變化。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 健康志愿者 選取20位健康志愿者，年齡20～45歲，無(wú)冠心病、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入或冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)史，無(wú)吸煙史、糖尿病史、高血壓病史，無(wú)先天性心臟病、心臟瓣膜疾病、心肌疾病，無(wú)腦卒中、外周血管病變、腎動(dòng)脈狹窄，無(wú)血液系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、自身免疫病、活動(dòng)性炎性疾病等慢性疾病及家族性遺傳病史。近2周未服用過(guò)替格瑞洛、阿司匹林等抗血小板藥物及抗凝藥或他汀類藥物。研究經(jīng)沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型C57小鼠和CCL2–/–小鼠各10只，雄性，8～10周齡。C57小鼠由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科提供；CCL2–/–小鼠品系背景為C57BL/6J，先期由南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院負(fù)責(zé)代繁。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用法規(guī)。

1.2 蛋白芯片篩選人血小板內(nèi)發(fā)生磷酸化的激酶抽取8位健康志愿者靜脈血，分離血小板，并按照是否進(jìn)行CCL2(終濃度1000ng/ml)刺激分為CCL2組(n=4)及對(duì)照組(n=4)，采用蛋白芯片篩選兩組血小板內(nèi)發(fā)生磷酸化的激酶。步驟如下：①提取人血小板總蛋白，測(cè)蛋白濃度。芯片每孔中加入1ml緩沖液(Array Buffer 1)，將膜編號(hào)朝上放置于相應(yīng)的孔中，置搖床上室溫孵育1h。②取200μg蛋白樣品，先加入緩沖液(Lysis Buffer 6)稀釋至334μl，充分混勻后，再加入緩沖液(Array Buffer 1)至2ml。③棄去芯片孔中的緩沖液(Array Buffer 1)，加入1ml稀釋后的蛋白樣品，置搖床上2～8℃孵育過(guò)夜。④將每張膜輕輕移至裝有20ml緩沖液(1×Wash Buffer)的獨(dú)立塑料容器中，置搖床上洗膜10min，重復(fù)3次。⑤取20μl Detection Antibody Cocktail A/B，加入至1×Array Buffer 2/3中充分混勻，用1×Array Buffer 2/3定容至1ml。芯片孔中加入1ml稀釋后的Detection Antibody Cocktail A/B。⑥將置于塑料容器中的膜移出，用紙巾吸干液體，輕輕放回芯片每個(gè)對(duì)應(yīng)的孔中，置搖床上室溫孵育2h。重復(fù)步驟4。⑦于芯片孔中加入1ml稀釋后的Streptavidin-HRP。將置于塑料容器中的膜移出，用紙巾吸干液體，放回芯片對(duì)應(yīng)的孔中，置搖床上室溫孵育30min。重復(fù)步驟4。⑧將置于塑料容器中的膜移出，用紙巾吸干液體，平鋪至塑料薄膜的底層上。吸取1ml Chemi Reagent Mix均勻滴在膜上，蓋上塑料薄膜的頂層，擠出氣泡，室溫孵育1min。⑨將膜置于暗匣中壓片。應(yīng)用Image Pro Plus軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 Western blotting檢測(cè)人血小板內(nèi)P38MAPK和HSP27的表達(dá) 抽取10例健康志愿者靜脈血，分離血小板，加入CCL2因子(終濃度1000ng/ml)，37℃孵育30min，室溫下3000r/min離心5min，棄上清，提取總蛋白。根據(jù)測(cè)得蛋白濃度計(jì)算上樣容量并將蛋白稀釋，于100℃水浴中煮沸5min，室溫下12 000r/min離心5min；灌膠、蛋白上樣及電泳后PVDF轉(zhuǎn)膜；將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜置于5%脫脂奶粉中，封閉2h；將PVDF膜置于一抗溶液(總P38MAPK 1:1000，pho-P38MAPK 1:1000，總HSP27 1:1000，pho-HSP27 1:1000，β-actin 1:2000)中，4℃條件下孵育過(guò)夜；次日將PVDF膜置于室溫下復(fù)溫，TBS-T洗膜，每次20min，重復(fù)3次；將PVDF膜置于二抗溶液(1:10 000)中，室溫下孵育2h；TBST洗膜，每次20min，重復(fù)3次。將ECL適量滴于PVDF膜上，置暗匣內(nèi)壓片，采用Image Pro Plus軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行分析。

1.4 Western blotting檢測(cè)小鼠血小板內(nèi)P38MAPK和HSP27的表達(dá) 分離野生型C57及CCL2–/–小鼠血小板，加入膠原(終濃度5μg/ml)，于37℃孵育30min，室溫下3000r/min離心5min，棄上清，提取總蛋白行Western blotting檢測(cè)，步驟同1.3。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，兩組樣本間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白芯片檢測(cè)CCL2因子刺激后的激酶磷酸化水平 經(jīng)CCL2因子(1000ng/ml)體外刺激人血小板后，有12種激酶磷酸化位點(diǎn)的磷酸化程度明顯升高，包括p38α(T180/Y182)、EGF R(Y1086)、MSK1/2(S376/S360)、AMPKα1(T183)、HSP27(S78/S82)、Lck(Y394)、STAT2(Y689)、Yes(Y426)、Chk-2(T68)、FAK(Y397)、PDGF Rβ(Y751)、c-Jun(S63)等(圖1)。

圖1 經(jīng)CCL2刺激后12種磷酸化位點(diǎn)磷酸化程度升高的激酶(n=4)Fig.1 Twelve phosphokinases increased by stimulation of CCL2 (n=4)

2.2 Western blotting檢測(cè)CCL2因子刺激后的激酶磷酸化水平 Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)CCL2因子(1000ng/ml)體外刺激后，人血小板內(nèi)P38MAPK(T180/Y182)、HSP27(S78/S82)的磷酸化表達(dá)明顯高于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2)，與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。

圖2 Western blotting驗(yàn)證CCL2因子刺激對(duì)血小板激酶磷酸化的影響(n=5)Fig.2 Effect of CCL2 stimulation on the phosphorylation of platelet phosphokinases (Western blotting, n=5)

2.3 小鼠血小板內(nèi)P38MAPK和HSP27的表達(dá)差異 Western blotting結(jié)果表明，與未經(jīng)膠原刺激比較，經(jīng)5μg/ml膠原刺激的野生型C57小鼠，其血小板內(nèi)P38MAPK(T180/Y182)、HSP27(S78/S82)的磷酸化表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；而經(jīng)膠原刺激的CCL2–/–小鼠血小板內(nèi)P38MAPK(T180/Y182)、HSP27(S78/S82)的磷酸化表達(dá)則明顯低于經(jīng)膠原刺激的野生型C57小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 膠原刺激對(duì)小鼠血小板P38MAPK和HSP27表達(dá)的影響Fig.3 Effect of collagen stimulation on the expressions of mouse' platelet P38MAPK and HSP27

3 討 論

P38MAPK是目前已知的3個(gè)MAPKs家族成員之一[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，MAPKs在調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)及促進(jìn)炎癥和血管性疾病的發(fā)展中具有重要作用[6]。MAPKs在人血小板中有表達(dá)，可以加強(qiáng)磷脂酶A2的活性和促進(jìn)血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)的形成，而TXA2是血小板釋放和聚集的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑[7-8]。研究顯示，P38MAPK在凝血酶誘導(dǎo)的血小板顆粒分泌過(guò)程中明顯活化，預(yù)先應(yīng)用P38MAPK的抑制劑SB 203580處理人血小板，可以明顯降低血小板分泌PF4和CD40L[9]。CCL2誘導(dǎo)的P38MAPK活化可以被抗血小板藥物西洛他唑抑制，降低AS早期單核細(xì)胞的浸潤(rùn)[10]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性應(yīng)用CCL2因子刺激人血小板會(huì)導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路上關(guān)鍵激酶P65的磷酸化水平升高，該通路上的拮抗劑IκBα水平降低；應(yīng)用CCR2拮抗劑RS201895或NF-κB信號(hào)通路抑制劑Bay11-7082預(yù)處理人血小板后，再應(yīng)用CCL2刺激血小板，P65的磷酸化水平降低，IκBα水平升高，提示CCL2/CCR2可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路影響血小板功能[11]。本研究應(yīng)用蛋白芯片篩選并采用Western blotting驗(yàn)證，結(jié)果顯示，人血小板在外源性CCL2因子的刺激下，P38MAPK(T180/Y182)和HSP27(S78/S82)的磷酸化表達(dá)均明顯升高，提示CCL2可能通過(guò)P38MAPK信號(hào)通路調(diào)控血小板活化。

HSP27在熱刺激、內(nèi)毒素、氧自由基等應(yīng)激狀態(tài)下明顯表達(dá)，具有多種調(diào)節(jié)功能，不僅能維持細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白和微管的穩(wěn)定[12-14]，還參與蛋白翻譯后的修飾，包括HSP27的磷酸化，是HSPs家族中最重要的一員[15]。在血小板未激活狀態(tài)下，HSP27大部分處于非磷酸化的聚集形式，一旦血小板被激活，HSP27發(fā)生磷酸化并快速解離[16]。但目前還沒(méi)有CCL2誘導(dǎo)后血小板內(nèi)HSP27發(fā)生活化的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，外源性CCL2刺激人血小板可促使血小板內(nèi)HSP27的磷酸化表達(dá)增加。

Saklatvala等[17]報(bào)道，在膠原誘導(dǎo)血小板激活的過(guò)程中，P38MAPK被活化后可促使MAPK活化蛋白激酶2發(fā)生活化，進(jìn)而加強(qiáng)HSP27的磷酸化表達(dá)。Alarayyed等[18]發(fā)現(xiàn)，在膠原誘導(dǎo)血小板活化并釋放CD40L的過(guò)程中，在MAPKs家族成員P38MAPK或ERK1/2的催化作用下，HSP27通過(guò)調(diào)控血小板內(nèi)骨架肌動(dòng)蛋白而使其磷酸化表達(dá)明顯增加。為了進(jìn)一步證實(shí)CCL2參與對(duì)血小板內(nèi)P38MAPK和HSP27的活化，本研究提取野生型C57小鼠和CCL2–/–小鼠血小板，并采用膠原刺激血小板，比較血小板內(nèi)P38MAPK和HSP27磷酸化的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CCL2–/–小鼠血小板內(nèi)P38MAPK和HSP27的磷酸化表達(dá)均降低，表明膠原與CCL2對(duì)血小板的激活不是各自獨(dú)立的，其在對(duì)P38MAPK和HSP27的活化過(guò)程中，加強(qiáng)了CCL2對(duì)P38MAPK-HSP27信號(hào)通路的活化，推測(cè)趨化因子CCL2可能通過(guò)P38MAPK-HSP27通路調(diào)控血小板的活化。