燈盞花素對大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細胞凋亡及NF-kB通路信號分子α7nAChR、p65、IkB-α的影響

丁丹，焦麗華，王雪臣，劉振宇，范立華，李慶海

心肌梗死是近些年導致我國居民死亡的主要原因。針對急性心肌梗死（AMI），臨床多采用經(jīng)皮冠狀動脈介入術（PCI）、藥物溶栓治療或冠狀動脈旁路移植術（CABG）以便恢復心肌再灌注，縮小梗死范圍，這些措施明顯提高了AMI的搶救成功率以及改善了患者預后[1]。但是心肌缺血再灌注（IR）損傷的存在降低了部分AMI的再灌注療效[2]。研究表明，心肌細胞凋亡與心肌IR損傷顯著相關，給予抗細胞凋亡干預可顯著縮小心肌梗死范圍，減輕再灌注損傷[3]。

燈盞花素是從中藥燈盞花中分離得到的黃酮類化合物，具有擴張冠狀動脈血管，增加冠狀動脈血流量，改善局部血供等作用，臨床多用于冠心病、心絞痛及急性心肌梗死的治療[4]。但對于燈盞花素緩解心絞痛癥狀，改善心肌缺血的具體機制并未十分明確。膽堿能抗炎通路（CAP）是一種內源性神經(jīng)反饋炎癥調節(jié)機制，能通過傳出迷走神經(jīng)刺激而釋放乙酰膽堿（ACh）并特異性結合α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAChR），并通過抑制NF-kB信號通路（NF-kB）抑制致炎細胞因子釋放[5]。因此本研究擬建立大鼠體內心肌缺血再灌注（MIRI）損傷模型，觀察燈盞花素對IR大鼠心肌細胞凋亡及α7nAChR、p65、IkB-α表達的影響，以期從膽堿能抗炎及NF-kB信號通路揭示燈盞花素防治心肌梗死的作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器原位末端標記（TUNEL）檢測試劑盒及DAB顯色試劑購自福建邁新公司產(chǎn)品。p65、IkB-α、β-actin以及α7nAChR鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司。蛋白定量試劑盒購自中國碧云天公司。燈盞花素注射液購自吉林龍?zhí)┲扑幑煞萦邢薰?。Genios多功能酶標儀購自瑞士Tecan公司；BIO- RAD電泳、轉膜系統(tǒng)購自美國BIO- RAD公司；DU730紫外可見分光光度計購自美國 Beckman公司；PM- 10AD倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；ChemiDoc TM XRS+凝膠成像儀器購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗動物及分組健康SD大鼠40只，體量為220±20g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。將以上大鼠隨機分為四組：假手術組、缺血再灌注組、燈盞花素低劑量（25 mg/kg·d）組和燈盞花素高劑量組（50 mg/kg·d）各10只。4組均制備 MIRI 模型，其中燈盞花素預處理組，于術前分別連續(xù)1周腹腔注射燈盞花素；假手術組以及缺血再灌注組分別注射等量的生理鹽水。

1.3 缺血再灌注大鼠模型（MIRI）的制備以上各組大鼠經(jīng)腹腔注射10%烏拉坦麻醉(1ml/100 g)，采用仰臥位固定大鼠，并使用用針型電極插入四肢皮下記錄標準肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖。于胸骨左緣3～4肋間采用左胸正中旁切口開胸，暴露心臟，在左心室與肺動脈干之間結扎左冠狀動脈前降支，同時在結扎線與血管之間穿一直徑為2 mm、長為5 mm的硅膠管，結扎30 min; 然后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注2 h。假手術組僅分離前降支，不結扎。以收緊結扎線后動物的心電圖標準導聯(lián) ST-T段抬高，放松后抬高的ST-T下降1/2以上為MIRI模型建立成功[6]。

1.4 各組大鼠心肌組織梗死面積的檢測以上各組大鼠于建立MIRI模型后，同樣經(jīng)腹腔注射10%烏拉坦麻醉，開胸取出心臟。各組大鼠部分心臟組織于-20℃冷凍30 min后，沿心臟左心室長軸，每隔1 mm切取1 mm厚的切片數(shù)張，置于1% TTC溶液中、37℃避光孵育15 min，正常組織呈紅色、梗死區(qū)呈灰白色，通過BI- 2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)計算心肌組織梗死面積（梗死面積/視野面積）[7]。

1.5 TUNEL法檢測心肌細胞的凋亡取以上各組大鼠制備的組織切片，按照TUNEL染色試劑盒方法步驟，通過光學顯微鏡觀察各組大鼠心肌細胞凋亡狀況（胞核黃染為陽性著色）；每只大鼠取5張切片，每張切片隨機選取10個視野，測定陽性染色平均光密度值以及陽性染色面積率，計數(shù)細胞總數(shù)及陽性細胞數(shù)，然后計算心肌細胞凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)=（陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%[8]。

1.6 蛋白印記法檢測α7nAChR、p65、IkB-α蛋白的表達準確稱取以上各組大鼠的心肌組織100 mg，在冰塊上剪碎后迅速移入組織破碎儀中，并加入400 μl 4℃預冷的總蛋白提取液，隨后轉入1.5 ml EP管中冰浴30 min，并于4℃，10 000 r/min離心機中離心10 min，隨后取上清，參照試劑盒說明用Bradford方法測定總蛋白濃度，并統(tǒng)一調整蛋白濃度為5 μg/ml。

隨后抽取以上各組大鼠20 μl蛋白變性后上樣，于質量分數(shù)為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳后，電轉至硝酸纖維膜，隨后加入鼠抗人單克隆α7nAChR、p65、IkB-及β-actin一抗、辣根過氧化物酶標志鼠抗兔二抗，化學底物發(fā)光法顯色，圖像掃描分析。顯影的條帶采用 Image-QuaNT軟件測量其光密度,以各β-actin為內參，計算各組蛋白相對光密度值[9]。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05則認為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織梗死面積的比較與假手術組比較，缺血再灌注組心肌梗死面積顯著增加（P＜0.01），表明所建立MIRI模型成功；燈盞花素高低劑量組較缺血再灌注組心肌梗死面積顯著減少（P＜0.05），并且燈盞花素高劑量組較低劑量組心肌梗死面積仍顯著減少（P＜0.05），表明燈盞花素有效降低了MIRI模型大鼠心肌梗死面積并且燈盞花素高劑量組療效優(yōu)于低劑量干預組（表1）。

2.2 各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的比較與假手術組比較，缺血再灌注組陽性染色面積率以及心肌細胞凋亡指數(shù)顯著增加（P＜0.01）；燈盞花素干預組較缺血再灌注組染色面積率以及心肌細胞凋亡指數(shù)顯著減少（P≤0.05，且燈盞花素高劑量干預組較低劑量干預組染色面積率以及心肌細胞凋亡指數(shù)仍顯著減少（P≤0.05，表明燈盞花素有效降低了MIRI模型大鼠心肌凋亡指數(shù)并且燈盞花素高劑量組在降低心肌凋亡指數(shù)方面要優(yōu)于低劑量組（表2，圖1）。

表1 各組大鼠心肌組織梗死面積的比較

表2 各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的變化

圖1 各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)的變化（與假手術組比較，**P＜0.01；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05；與缺血再灌注組比較，##P＜0.01；與燈盞花素低劑量組比較，&P＜0.05）

2.3 各組大鼠心肌組織p65蛋白表達的比較與假手術組比較，缺血再灌注組p65蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；燈盞花素干預組較缺血再灌注組p65蛋白表達顯著增加（P＜0.05），并且燈盞花素高劑量干預組較低劑量干預組p65蛋白表達顯著增加（P＜0.05），以上結果表明MIRI缺血再灌注損傷大鼠p65蛋白顯著減少，并且燈盞花素的干預顯著增加了MIRI缺血再灌注損傷大鼠p65蛋白的表達量（圖2）。

2.4 各組大鼠心肌組織IkB-α蛋白表達的比較與假手術組比較，缺血再灌注組IkB-α蛋白顯著增加（P＜0.01）；燈盞花素干預組較缺血再灌注組IkB-α蛋白表達顯著降低（P＜0.05），并且燈盞花素高劑量干預組較低劑量干預組IkB-α蛋白表達顯著降低（P＜0.05），以上結果表明MIRI缺血再灌注損傷大鼠IkB-α蛋白顯著增加，并且燈盞花素的干預顯著降低了MIRI缺血再灌注損傷大鼠IkB-α蛋白的表達量（圖3）。

圖2 各組大鼠心肌組織p65蛋白表達的比較

2.5 各組大鼠心肌組織α7nAChR蛋白表達的比較與假手術組比較，缺血再灌注組α7nAChR蛋白顯著降低（P＜0.01）；燈盞花素干預組較缺血再灌注組α7nAChR蛋白表達顯著增加（P＜0.05），并且燈盞花素高劑量干預組較低劑量干預組α7nAChR蛋白表達顯著增加（P＜0.05），以上結果表明MIRI缺血再灌注損傷大鼠α7nAChR蛋白顯著降低，并且燈盞花素的干預顯著增加了MIRI缺血再灌注損傷大鼠α7nAChR蛋白的表達量（圖4）。

3 討論

圖3 各組大鼠心肌組織IkB-α蛋白表達的比較

冠心?。–HD）是全球死亡和致殘的主要原因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，每年全球死亡人數(shù)約為7 254 000人（占所有死亡人數(shù)的12.8%）。冠心病的影響多數(shù)歸因于急性心肌缺血[10]。它通常出現(xiàn)在急性ST段抬高心肌梗死（STEMI）的患者中，而減少急性心肌缺血性損傷和心肌梗塞（MI）的最有效的治療是及時使用溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）增加心肌再灌注[11]。然而心肌再灌注過程本身可誘導進一步的心肌細胞凋亡，并且尚無有效的預防心肌再灌注損傷的治療方法，因此更及時和有效的藥物支持來改善再灌注損傷成為研究的重點。

圖4 各組大鼠心肌組織α7nAChR蛋白表達的比較

燈盞花素又名野黃芩甙元，是中藥燈盞的有效成分，為較強的非競爭性蛋白激酶C（PKC）抑制劑。多種體內和體外研究的證據(jù)表明，燈盞花素具有廣泛的心血管藥理作用，包括血管舒張，防止局部缺血/再灌注損傷（I/R），抗炎，抗凝，抗血栓形成，內皮保護，心肌保護，減少平滑肌細胞遷移和增殖等作用[12,13]。本研究顯示，燈盞花素可以有效降低MIRI模型大鼠心肌梗死面積以及心肌凋亡面積和指數(shù)并且具有一定的劑量依賴性，這將為燈盞花素應用于心肌梗死患者提供了有效的實驗依據(jù)。

同時相關研究表明燈盞花素對心血管缺血的保護作用以及燈盞花素對心肌細胞凋亡的影響可能涉及多種機制，包括干擾調節(jié)某些基因表達的特定途徑和激活相關的ATP酶[14]。相關研究顯示燈盞花素可能通過PI3K/Akt/eNOS信號通路抑制心肌細胞的凋亡從而對心肌梗死I/R損傷提供有效的保護作用[15]。此外另一項研究表明，燈盞花素可以抑制IL-18和ICAM-1在肺部的表達，從而免受炎癥級聯(lián)反應的影響[16]；另外，燈盞花素可通過降低心肌ICAM-1蛋白表達，增加Na+-K+-ATP酶，Mg2+-ATP酶，Ca2+-ATP酶在心肌線粒體中的表達，從而增加氧自由基清除發(fā)揮心肌的保護作用[17]。

在各種刺激因素作用下，迷走神經(jīng)通過膽堿能抗炎通路促使主要神經(jīng)遞質乙酰膽堿大量釋放，從而抑制巨噬細胞活化，抑制促炎因子生成和釋放，最終抑制局部或全身的炎癥反應[18]。CAP是一種內源性的神經(jīng)反饋調節(jié)機制，從α7nAChR被激活起至發(fā)揮抗炎作用主要是通過兩大信號通路：抑制核轉錄因子NF-κB通路和激活Janus激酶2及信號轉導子和轉錄激活子3（Jak2/STAT3）通路[19]。其中NF-κB 是I/R損傷過程中較早參與的一個調節(jié)蛋白，能調節(jié)多種參與I/R 損傷的細胞因子、炎性介質、粘附分子的基因轉錄過程，從而控制它們的生物合成。

NF-kB是近年研究較熱的一個基因轉錄調控蛋白，它廣泛地參與細胞生長、分化、免疫和炎癥反應，產(chǎn)生抗凋亡、促增殖的作用，是細胞重要的信號傳遞通路，可通過調節(jié)一系列基因轉錄、表達而發(fā)揮其抗凋亡作用。研究表明，NF-kB-p65蛋白以及其抑制性蛋白IkB-α在炎癥反應、細胞增殖凋亡乃至腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。本研究表明，MIRI缺血再灌注損傷大鼠p65蛋白和α7nAChR蛋白顯著減少，IkB-α蛋白顯著增加；并且燈盞花素的干預顯著增加了MIRI缺血再灌注損傷大鼠p65和α7nAChR蛋白的表達量，降低了IkB-α蛋白的表達量。因此燈盞花素通過CAP介導的NF-kB通路有效介導了抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，膽堿能抗炎以及NF-kB通路在心肌缺血再灌注損傷的形成過程中有重要的作用，并且燈盞花素可通過CAP調節(jié)下的NF-kB通路有效發(fā)揮了抑制心肌細胞凋亡的功能。