膠孢炭疽菌對核桃葉生理生化特性的影響

徐慧娟 王蕊蕊 楊振德 吳廣 蒙海勤 汪筱雪

摘要：以離體的泡核桃（Juglans sigillata Dode）葉為材料，研究了膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）對核桃（Juglans regia L.）葉生理生化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，接種膠孢炭疽菌感病后核桃葉片內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性均隨著感病時間的延長呈先升高后降低的趨勢，過氧化物酶（POD）活性則隨著感病時間的延長呈先下降后升高的趨勢，核桃葉發(fā)病第三天和第五天的SOD、POD和CAT活性均顯著高于對照;丙二醛（MDA）、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量均隨著核桃葉感病時間的延長呈現(xiàn)出升高的趨勢，其中，MDA含量在感病的第三天和第五天均顯著高于對照，而可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量與對照差異不顯著;葉綠素含量隨著核桃葉感病時間的延長而下降，在感病第五天葉綠素含量顯著低于對照;感病核桃葉的凈光合速率顯著低于對照，氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率則與對照差異不顯著?？梢?，膠孢炭疽菌感染對泡核桃葉片的生理生化特性有顯著影響。

關(guān)鍵詞：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）;核桃（Juglans regia L.）;生理生化指標(biāo)

中圖分類號：S763.15;S436.64? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）22-0070-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.020? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Taking leaves of bubble walnut（Juglans sigillata Dode） in vitro as materials，the effects of physiological and biochemical of Colletotrichum gloeosporioides on walnut （Juglans regia L.） leaves were studied. The results showed that the activity of superoxide dismutase（SOD） and catalase（CAT） in walnut leaves after inoculated with Colletotrichum gloeosporioides decreased with the increase of the time of onset，peroxidase（POD） activity increased at first and then descend with the time increasing，protective enzyme activity of the third day and the fifth day after inoculated was significantly higher than that of the control group. Change of malonaldehyde（MDA），soluble protein and soluble sugar content in walnut leaves after inoculation with Colletotrichum gloeosporioides showed a rising trend with the extension of the time of onset， among， the content of MDA was significantly higher than the control group in the third and the fifth days，soluble protein and soluble sugar content was not significant with control. The net photosynthetic rate of walnut leaf which infected with walnut anthracnose was significantly lower than healthy walnut leaf. Stomatal conductance， intercellular carbon dioxide concentration and transpiration rate of walnut leaf which infected with walnut anthracnose was were not significant with control. Thus， it can be seen that the effects of physiological and biochemical of Colletotrichum gloeosporioides on walnut leaves were significant.

Key words： Colletotrichum gloeosporioides; walnut（Juglans regia L.）; physiological and biochemical indicators

核桃（Juglans regia L.）原產(chǎn)中亞，為胡桃科（Juglandaceae）核桃屬（Juglans）落葉喬木，核桃、腰果、扁桃和榛子一起被稱為世界四大堅果。由于核桃具有很高的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值，越來越受到人們的喜愛，使得核桃的需求量很高;再加上核桃比其他水果管理容易，投入成本更小，所以深受果農(nóng)的歡迎。近些年來，廣西河池市核桃種植面積不斷擴(kuò)大，但是核桃大面積的種植面臨較嚴(yán)重的病蟲害問題，其中核桃炭疽病是核桃的主要病害之一。葉片感染核桃炭疽病后病斑呈圓形或不規(guī)則狀，天氣潮濕時病斑上出現(xiàn)粉紅色的分生孢子，發(fā)病嚴(yán)重時全葉枯黃脫落[1]。核桃炭疽病的病原菌經(jīng)過鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[2，3]，其最適合生長的溫度為28 ℃，在中性環(huán)境下菌株生長最好[2]。核桃炭疽病易發(fā)生于高濕高溫的環(huán)境中，7、8月是發(fā)病的高峰期[1]。對于核桃炭疽病的防治主要采用的是物理防治、化學(xué)防治和生物防治等方法[4，5]。前人主要是對核桃炭疽病的癥狀、病菌的鑒定與生物學(xué)特性、發(fā)病規(guī)律和核桃炭疽病的防治進(jìn)行研究[1-5]，但關(guān)于炭疽病菌對寄主植物核桃的生理代謝影響尚未見報道。本試驗研究了核桃葉接種膠孢炭疽菌發(fā)病后，其體內(nèi)的生理生化指標(biāo)的變化，旨在闡明炭疽病菌的致病機(jī)制及其與寄主植物的互作關(guān)系，為抗炭疽病核桃的選育提供理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

核桃葉片采集于廣西大學(xué)林學(xué)院實驗教學(xué)基地的兩年生泡核桃（Juglans sigillata Dode）。供試的炭疽菌菌株為作者所在實驗室從廣西河池市患病的泡核桃樹果實和葉片上分離純化的膠孢炭疽菌。

1.2? 方法

1.2.1? 炭疽病菌的接種? 選取形態(tài)和生長狀況一致的核桃葉，用自來水輕輕沖洗3次后，浸泡在75%乙醇中進(jìn)行表面殺菌，再用去離子水將表面的乙醇沖洗干凈并晾干。采用菌餅接種的方法，每片葉子上接種8塊菌餅，在接種菌餅之前，先用手術(shù)針在接菌餅的原位置扎2個孔，再接種于核桃葉的正面一側(cè)（另一側(cè)保持完整），以葉脈為中心，每半邊各對稱接種4塊菌餅。以空白的PDA培養(yǎng)基接種作為對照。將試驗核桃葉插在有水燒杯中培養(yǎng)，外套密封保鮮袋，每天定時噴灑水進(jìn)行保濕。分別于接種后發(fā)現(xiàn)病斑（判斷為感?。┑牡谝惶?、第三天和第五天取病斑組織和對照未感病的組織來測定保護(hù)酶活性，每個處理每個時間點各取3片葉子，并設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2? 核桃葉保護(hù)酶的測定? 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的測定采用氮藍(lán)四唑（Nitroblue tetrazolium，NBT）光化還原法，以抑制NBT光化還原50%為1個酶活性單位[6，7];過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性的測定用愈創(chuàng)木酚染色法，以1 min內(nèi)吸光度A470 nm變化0.01為1個酶活性單位[7];過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性的測定用紫外吸收法[8]。

1.2.3? 核桃葉生理生化指標(biāo)的測定? 丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[7];可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)方法[9];可溶性糖含量測定采用蒽酮法[10];葉綠素含量的測定采用分光光度法。

1.2.4? 光合作用參數(shù)的測定? 選擇有足夠光照的11：00左右，采用LI-6400便攜式光合儀（LI-COR公司） 測定發(fā)病第七天的泡核桃的光合指標(biāo)。選取樹冠中部高度一致和向陽方位光照充足的枝條上的健康與患有核桃炭疽病病害的完整葉片各3片，每片葉重復(fù)3次，同時注意所選擇的葉片葉位均一致，分別測定凈光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（Stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（Intercellular CO2 concentration，Ci）和蒸騰速率（Transpiration rate，Tr）等值。

1.2.5? 數(shù)據(jù)處理與分析? 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用t檢驗進(jìn)行差異顯著性（P<0.05）分析，試驗數(shù)據(jù)最終用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 核桃葉感染膠孢炭疽菌后保護(hù)酶活性的變化

植物受逆境脅迫時，體內(nèi)的氧化還原平衡被打破，導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生，活性氧的累積又會對植物造成氧化傷害。為使活性氧代謝保持平衡，體內(nèi)會形成一系列清除活性氧的保護(hù)酶類，以使自身免受活性氧的損害[11]。由圖1可以看出，核桃葉SOD和CAT的活性隨著感病時間的延長呈先升高后降低的趨勢，POD活性則隨著感病時間的延長呈先下降后升高的趨勢。感病狀態(tài)下核桃葉的酶活性均比正常狀態(tài)下核桃葉的酶活性高。經(jīng) t檢驗顯示，感病第一天SOD、POD、CAT的酶活性與對照無顯著差異（P>0.05），但感病第三天和第五天均顯著高于對照。

2.2? 核桃葉感染膠孢炭疽菌后生理生化指標(biāo)的變化

MDA、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖都是細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝的物質(zhì)。MDA含量的多少可以反映細(xì)胞受傷害的程度，可溶性蛋白質(zhì)含量增加可以提高植物自身的抗逆性，可溶性糖含量增加能使植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力得到提高[12]。由圖2可知，MDA、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量均隨著感病時間的延長而升高，其中MDA含量在發(fā)病的第三天和第五天顯著高于對照，第五天含量最高，為73.63 μmol/g，為對照組的1.37倍;而可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量與對照差異不顯著。

葉綠素是植物光合色素中最重要的一類色素，其含量可受多種逆境的脅迫而下降。由圖2可知，葉綠素含量隨著感病時間的延長而減少，在第五天顯著低于對照，僅為對照的50.6%，表明膠孢炭疽菌侵染核桃葉會使得感病植株的葉綠素含量明顯減少，從而使得植物的光合能力減弱。其原因一方面可能是由于病原菌的入侵增強(qiáng)了感病植株葉片中葉綠素酶的活性，促進(jìn)葉綠素降解;另一方面，病原菌導(dǎo)致了感病植株葉片的光能利用率降低[13]，過量的光能使葉綠素成為三線態(tài)，通過電子傳遞、產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2）、羥自由基（·OH）和超氧自由基（O2-）等活性氧，從而破壞 DNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物及膜脂等生物分子的結(jié)構(gòu)，降解了葉綠素分子[14]。

2.3? 核桃葉感染膠孢炭疽菌后光合作用指標(biāo)的變化

由表1可知，發(fā)病核桃葉的凈光合速率顯著低于健康核桃葉，僅為對照的56%，而氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率則均高于對照，但差異不顯著。

3? 小結(jié)與討論

植株感染病菌后，其體內(nèi)會發(fā)生一系列的生理反應(yīng)來抵御病菌的侵害。植物在正常情況下體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡，但病害發(fā)生時會打破這個平衡，細(xì)胞內(nèi)活性氧過量積累對植物細(xì)胞產(chǎn)生明顯的毒害作用，同時引起和加劇膜脂的過氧化作用，破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能，引起植物細(xì)胞的死亡[15]。SOD、POD和CAT是主要的活性氧清除酶系，其作用是抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細(xì)胞免受活性氧傷害。本研究結(jié)果表明，隨著接種膠孢炭疽菌時間的延長，SOD、POD和CAT酶活性始終高于對照，這有利于減輕接種病菌造成的活性氧對核桃葉片器官膜的傷害，從而抑制病菌的擴(kuò)展，提高核桃葉抵御核桃炭疽病的能力。不少研究結(jié)果表明，寄主植物感染病原菌后體內(nèi)保護(hù)酶活性產(chǎn)生顯著變化[16-18]。如黃櫨在感染大麗輪枝菌后，其體內(nèi)SOD先上升后下降[16];梨果實在感染炭疽病后，POD活性呈現(xiàn)先上升后下降再上升的變化趨勢[17];水稻在接種稻曲病菌后，CAT活性先升高后下降[18]。本研究結(jié)果與此相似，核桃葉感染膠孢炭疽菌后，SOD和CAT活性前期均較高，對病原菌有一定抑制作用，但在感染后期偏低，說明兩者不能有效防御病原菌的侵染。

MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的產(chǎn)物，能夠嚴(yán)重?fù)p傷生物膜并抑制細(xì)胞保護(hù)酶的活性，其含量高低反映植物受害的程度，也是導(dǎo)致感病葉片出現(xiàn)病斑的原因之一。核桃葉在接種膠孢炭疽菌后，MDA含量增加快，積累多，顯著高于對照，這與王偉[19]將白粉菌接種到葡萄上和張玉芳[14]把根腐病菌接種到當(dāng)歸上后葉片內(nèi)MDA含量的變化趨勢一致。保護(hù)酶活性在后期降低，使得活性氧含量增加，細(xì)胞膜受到的破壞加重，從而使MDA含量升高?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量的變化是植物生命活動中蛋白質(zhì)損傷的重要標(biāo)志，它可以反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、變性及降解等重要信息。感病核桃葉蛋白質(zhì)含量有所增高，這可能是在病原微生物侵染條件下，產(chǎn)生了誘導(dǎo)蛋白質(zhì)（如滲透蛋白質(zhì)、 核糖體失活蛋白質(zhì)等）的原因[20]?？扇苄蕴窃谏矬w內(nèi)主要參與呼吸代謝，為生物體生命活動提供所需的能量，也是生物體新陳代謝的重要中間產(chǎn)物。感病核桃葉可溶性糖含量的增加可能是膠孢炭疽菌的侵入刺激了核桃葉，使其呼吸作用增強(qiáng)，同時由于合成一些保護(hù)性物質(zhì)時需要消耗較多的物質(zhì)來源，從而促進(jìn)了多糖的分解[21]。葉綠素在一定范圍內(nèi)間接地反映了葉片的衰老程度，感病后葉綠素含量降低，說明核桃炭疽病加速了葉片的衰老，感病核桃葉葉綠素含量隨著時間的延長而逐漸降低，在第五天顯著低于對照，可能是接種膠孢炭疽菌后，葉內(nèi)產(chǎn)生的活性氧較多，SOD、POD和CAT等酶的產(chǎn)生量不足以消除過多的活性氧，使它們在葉綠體中積聚，破壞葉綠體，因而導(dǎo)致葉綠素含量下降，這與前人的研究一致[14，22]。

綜上所述，膠孢炭疽菌對核桃葉的生理生化特性有顯著影響。感病核桃葉的保護(hù)酶活性要比對照高，說明感病核桃葉還會產(chǎn)生更多的保護(hù)酶來清除由于炭疽病菌侵染后所累積的活性氧，而隨著感病時間的延長，SOD和CAT活性開始下降，說明此時活性氧的清除能力遭到極大削弱[23]，傷害加劇，出現(xiàn)葉片細(xì)胞死亡的外觀現(xiàn)象，從而導(dǎo)致MDA含量升高;可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、葉綠素的代謝混亂，合成減弱，分解加強(qiáng);導(dǎo)致光合作用失調(diào)，凈光合速率下降，最終感病核桃葉出現(xiàn)枯死的現(xiàn)象。

參考文獻(xiàn)：

[1] 時丕坤，宗殿龍.核桃炭疽病發(fā)生規(guī)律及防治措施[J].河北果樹，2017（5）：35.

[2] 王清海，劉幸紅，范? 昆，等.核桃炭疽病病原菌鑒定及生物學(xué)特性[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，47（1）：9-14.

[3] 曲文文.山東省核桃主要病害病原鑒定[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[4] 劉京偉，柴高正.核桃樹腐爛病的發(fā)生與防治[J].果樹實用技術(shù)與信息，2015（2）：31-32.

[5] 曾紹貴.核桃炭疽病及防治方法研究進(jìn)展[J].四川林業(yè)科技，2017，38（1）：108-110.

[6] 閻秀峰，李? 晶，祖元剛.干旱脅迫對紅松幼苗保護(hù)酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響[J].生態(tài)學(xué)報，1999，19（6）：850-854.

[7] 張志良，瞿偉菁.植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2003.

[8] 高俊鳳.植物生理學(xué)試驗指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2006.

[9] 華東師范大學(xué).植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京：人民教育出版社，1981.

[10] 肖浪濤，王三根.植物生理學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[11] ZHU J K. Cell signaling under salt，water and cold stress[J].Current Opinion in Plant Biology，2001，4（5）：401-406.

[12] 袁淑珍，栗淑媛，喬? 辰.低溫脅迫對螺旋藻體內(nèi)可溶性糖含量的影響[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（5）：113-116.

[13] 代紅軍，柯玉琴，潘廷國，等.甘薯蔓割病病原菌的侵染對甘薯光合作用的影響[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2004，33（3）：304-307.

[14] 張玉芳.根腐菌對當(dāng)歸種子萌發(fā)、幼苗生長及生理特征的影響[D].蘭州：西北師范大學(xué)，2014.

[15] 馬旭俊，朱大海.植物超氧化物歧化酶（SOD）的研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2003，25（2）：225-231.

[16] 王? 妍，田呈明，王永林.黃櫨與輪枝菌互作過程中活性氧及保護(hù)酶系的變化[A].中國植物病理學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文集[C].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2011.428.

[17] 趙? 梅.梨果實對炭疽病和輪紋病抗性生理的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[18] 陸? 君.稻曲病菌與水稻互作的初步研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[19] 王? 偉.葡萄白粉菌侵染過程及其對葉片相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響[D].西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

[20] 梁喜龍，鄭殿峰，左豫虎.病害逆境下寄主植物生理生化指標(biāo)的研究現(xiàn)狀與展望[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（15）：3576-3578.

[21] 劉慧芹.葉霉病菌毒素與番茄品種抗病性關(guān)系的研究[D].山西太谷：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[22] 趙慶芳，李海亮，王? 萊.病害脅迫對觀賞百合生理生化的影響[J].北方園藝，2007（4）：163-165.

[23] 李? 西，毛? 凱，熊? 曦，等.暖季型草坪草抗寒性研究進(jìn)展[J].中國草地，2002，22（4）：53-58.