微小隱孢子蟲分子流行病學(xué)

陳 苗，李 慧，唐 莉，闞珍珍，李文超，顧有方

（安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

隱孢子蟲?。–ryptosporidiosis）是世界范圍內(nèi)的人畜共患的寄生蟲疾病。其病原體是隱孢子蟲。宿主十分廣泛，寄生于人類，哺乳類，禽類，魚類等240多種脊椎動(dòng)物體內(nèi)。傳播途徑多通過糞-口途徑傳播，或通過食入含有卵囊的食物、水、接觸受污染的物品而感染，可以在人與人、人與動(dòng)物、動(dòng)物與動(dòng)物之間傳播。在動(dòng)物體上表現(xiàn)為腹瀉和呼吸道癥狀，在人體主要表現(xiàn)為腹瀉、惡心、嘔吐等癥狀，在營養(yǎng)不良或免疫功能受損、不全的人中最為明顯，甚至可以威脅生命，特別是在發(fā)展中國家。在患艾滋病的個(gè)體中，可以導(dǎo)致致死性腹瀉。因此，隱孢子蟲（Cryptosporidium）在公共衛(wèi)生上具有十分重要的意義。

1907年，Tyzzer首次在各種常見的小鼠的胃腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名為鼠隱孢子蟲（C.muris），此后，在1912年又在小鼠的腸道中發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)新物種并將其命名為微小隱孢子蟲（C.parvum）。隱孢子蟲是感染野生和家養(yǎng)動(dòng)物最廣泛傳播的原生動(dòng)物寄生蟲之一，被認(rèn)為是繼輪狀病毒之后導(dǎo)致兒童腹瀉的第二大主要原因。截止到目前為止，分子流行病學(xué)研究已經(jīng)鑒定30個(gè)有效種，40多種基因型，其中有21個(gè)隱孢子蟲蟲種在人體中發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)的隱孢子蟲的物種和基因型具有宿主特異性，對(duì)宿主的致病性也有較大的差異。大約20多種不同的物種會(huì)導(dǎo)致人類嚴(yán)重的中度感染，人隱孢子蟲（C.hominis）和微小隱孢子蟲（C.parvum）是最主要的病原體。人隱孢子蟲幾乎只感染人，而微小隱孢子蟲既可以感染人，也可以感染動(dòng)物，是最主要的人畜共患隱孢子蟲蟲種。其他的隱孢子蟲的蟲種感染的病例較少且呈現(xiàn)地區(qū)優(yōu)勢(shì)，多呈散發(fā)。隱孢子病對(duì)人類和動(dòng)物產(chǎn)生極大的威脅，產(chǎn)生了一定程度的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，其受到國內(nèi)外眾多學(xué)者的重視，成為寄生蟲學(xué)研究的熱門課題。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，用于隱孢子蟲基因型，基因亞型的分型工具也得到了快速的發(fā)展。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）就被廣泛的用于各領(lǐng)域隱孢子蟲檢測(cè)。目前，小亞基核糖體 rRNA（SSU rRNA）和 gp60（gp40/15）被用于區(qū)分物種基因型、基因亞型的最佳分子標(biāo)記，盡管，最近十年，診斷工具檢測(cè)基因型和亞型水平上鑒別隱孢子蟲的種類有所改善，但是我們對(duì)每個(gè)物種在動(dòng)物和人類的傳播潛力尚不明確。下面對(duì)感染人體最主要的微小隱孢子蟲蟲種的分子流行病學(xué)進(jìn)行綜述。

1 微小隱孢子蟲基因型及其亞型

最主要的感染人的兩個(gè)隱孢子蟲物種是人隱孢子蟲和微小隱孢子蟲。牛被公認(rèn)為人類隱孢子蟲病最主要的傳染源。除此之外還有火雞隱孢子蟲（C.meleagridis）、貓隱孢子蟲（C.felis）、犬隱孢子蟲（C.canis）等引起的人體感染的病例也在中國出現(xiàn)，個(gè)別蟲種呈現(xiàn)地區(qū)性的優(yōu)勢(shì)，這些蟲種是在沒有出現(xiàn)隱孢子蟲的情況下在郊區(qū)的兒童中發(fā)現(xiàn)的。在工業(yè)國家，例如，歐洲、澳大利亞、美國，人隱孢子蟲感染和微小隱孢子蟲感染是一樣廣泛的；然而，在中西方國家，從人群患寄生蟲疾病的病人中分離微小隱孢子蟲是占主導(dǎo)的物種，主要感染2歲以下的兒童，和15～45歲的女性。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，gp60被廣泛應(yīng)用于區(qū)分隱孢子蟲的基因亞型。gp60是目前鑒定的最為單一的多態(tài)性分子標(biāo)記，將隱孢子蟲的生物學(xué)特征，臨床表現(xiàn)和不同的亞型家族相聯(lián)系成為可能。在北美、歐洲和澳大利亞，一些常見的微小隱孢子蟲牛源IIa亞型和一些IId亞型在人群的病例中被發(fā)現(xiàn)。IIa是這些地區(qū)的微小隱孢子蟲的優(yōu)勢(shì)亞型且為犢牛廣為流行的亞型家族。在葡萄牙、荷蘭、北愛爾蘭和斯洛文尼亞，2種主要的IIa亞型IIaA15G2R1和IIaA18G3R1從人群患寄生蟲病例中分離出來，并且在牛群中也是常見的亞型。在葡萄牙，4種IId亞型發(fā)現(xiàn)于HIV+的人群當(dāng)中，先前有2個(gè)亞型在同一地區(qū)的羔羊和犢牛體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了，在荷蘭，一些人群也感染了3個(gè)IId亞型，但同一個(gè)研究中，在犢牛體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)IId亞型，在愛爾蘭和澳大利亞，2個(gè)人體病例中各發(fā)現(xiàn)了1個(gè)IId亞型，在美國和加拿大，人體和犢牛體內(nèi)都未檢測(cè)到IId亞型。在美國、加拿大、葡萄牙、斯洛文尼亞、英國、愛爾蘭、北愛爾蘭和澳大利亞，微小隱孢子蟲亞型家族IIc只在人類病例中發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)。IIc具有人-人傳播的特性且歸因于多數(shù)人體感染微小隱孢子蟲。在歐洲國家的市區(qū)，例如葡萄牙里斯本，IIa和IIc亞型在人體中都較為常見。在科威特，兒童僅感染IIa和IId亞型，需要我們注意的事情是，患微小隱孢子蟲亞型家族IIa和86%亞型家族IId的兒童都與動(dòng)物有親密的接觸，微小隱孢子蟲在動(dòng)物和人群中大范圍的流行和傳播且其基因型相同，這就意味著是由于人和動(dòng)物親密接觸而引起的傳播，其中IIdA20G1被認(rèn)為是最常見的亞型。與發(fā)達(dá)國家不同的是，在發(fā)展中國家，例如，印度、馬拉維、烏干達(dá)和肯尼亞，微小隱孢子蟲亞型家族IIb和IIe可以感染人類而在這些地區(qū)的同域動(dòng)物體內(nèi)沒有檢測(cè)到。在歐洲國家，II1型也偶爾會(huì)在斯洛文尼亞人群當(dāng)中發(fā)現(xiàn)存在。

2 診斷與檢測(cè)

2.1 飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色

傳統(tǒng)檢測(cè)微小隱孢子蟲的方法中常用的是飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色（MAF），MAF通過顯微鏡觀察能提高其敏感性為54.8%。其優(yōu)點(diǎn)是成本低，操作方便簡單，敏感性較低，然而，容易出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象，造成實(shí)驗(yàn)的不準(zhǔn)確性。

2.2 Ziehl-Neelsen技術(shù)

改進(jìn)的Ziehl-Neelsen技術(shù)能夠檢測(cè)大多數(shù)有很高流行率的隱孢子蟲屬。然而顯微鏡的測(cè)定方法有一些限制因素，特別是在非流行地區(qū)有少量卵囊感染窩藏的診斷中，還有一些大小在4～6um的卵囊很容易和糞便樣本中的其他樣本混淆。

2.3 免疫學(xué)檢測(cè)

免疫學(xué)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELASE），直接熒光抗體檢測(cè)（DFA）等，這兩種方法被廣泛的使用于抗體特異性檢測(cè)，DFA檢測(cè)的敏感性特異性達(dá)到96%～100%和99%～100%，ELASE檢測(cè)的敏感性特異性達(dá)到94%～97%和99%～100%。

2.4 PCR技術(shù)

1991年，Laxer第一次將PCR技術(shù)用于檢測(cè)隱孢子蟲，此后PCR技術(shù)就被廣泛的應(yīng)用于各種隱孢子蟲蟲種鑒定和基因分型。目前分子生物學(xué)檢測(cè)有普通PCR，巢式PCR（Nested PCR），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段多態(tài)性分析（PCR-RFLP）等。PCR技術(shù)是目前隱孢子蟲檢測(cè)最敏感最快速的方法之一。其敏感性可達(dá)到97%-100%，特異性能達(dá)到100%。最佳的基因標(biāo)記位點(diǎn)有小亞基核糖體rRNA（SSU rRNA）,卵囊壁蛋白（COWP）,熱休克蛋白（HSP70）等。在每個(gè)物種內(nèi)他們是保守的，然而，在不同的物種間他們又是具有多態(tài)性的。這些標(biāo)記通常被放大，通過使用特定的引物從臨床樣本中的直接提取DNA片段，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序或RELP。SSU rRNA具有多拷貝性，高變保守的特點(diǎn)，使其被廣泛的使用（86%的出版物中）去分離環(huán)境、野生或家養(yǎng)的動(dòng)物和人類樣本,幾乎可以鑒別出隱孢子蟲所有的物種。而基于COWP基因的工具116個(gè)原始出版物中僅用于23個(gè)（許多結(jié)合基于SSU rRNA的工具）,其他基因幾乎沒有使用過。

2.5 全基因組測(cè)序和多位點(diǎn)序列分型

目前，已經(jīng)制定了程序來促進(jìn)全基因組測(cè)序（WGS）和高級(jí)分型人類致病性隱孢子蟲屬。全基因組測(cè)序（WGS）和多位點(diǎn)序列分型（MLST）工具被中國的科學(xué)家使用在劇毒或超傳染性的微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲的亞型中。但是動(dòng)物模型和體外培養(yǎng)體系不能夠獲得足夠數(shù)量的經(jīng)過純化過后的卵囊，所以，全基因組測(cè)序遇到了阻礙，截止到目前只有3個(gè)隱孢子蟲種4個(gè)蟲株被測(cè)序?？傊?，基因型和亞型分型工具廣泛的使用于各種動(dòng)物的隱孢子蟲屬的鑒定。

3 預(yù)防與治療

雖然隱孢子蟲病的給人類和動(dòng)物帶來巨大危害，對(duì)人類和動(dòng)物造成生命威脅，產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟(jì)損失，具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。但是，現(xiàn)在用于治療隱孢子蟲病的藥物和疫苗卻是少之又少，只有少數(shù)藥物用于治療，國外的學(xué)者已經(jīng)篩選出了40多種藥物來治療隱孢子蟲，但大多數(shù)都是沒有療效的。阻礙新型抗寄生蟲藥物發(fā)展的原因是隱孢子蟲和其他的頂復(fù)門原蟲相比較在很大程度上是由于他的獨(dú)特代謝的結(jié)果，缺乏頂質(zhì)體和基因改造工具，最重要的是缺乏動(dòng)物模型來驗(yàn)證藥物的療效。當(dāng)前被食品藥物管理局批準(zhǔn)的藥物硝唑尼特被廣泛的使用在兒童和在有免疫活性的病人。而在免疫缺陷的病人中被認(rèn)為是無效的。還有一些沒有被食品藥物管理局批準(zhǔn)的藥物如巴龍霉素，其療效不如硝唑尼特。車等,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂及雙氫青篙素聯(lián)合應(yīng)用殺滅隱孢子蟲效果較好。隨著基因的發(fā)展轉(zhuǎn)變和其他的反向基因技術(shù)加上新穎的動(dòng)物模型已經(jīng)打開了尋找隱孢子蟲病的藥物發(fā)現(xiàn)篩選過程的大門。

“預(yù)防大于治療”，這是所有疾病所遵從的原則，寄生蟲疾病也不例外。由于隱孢子蟲病的傳播途徑多通過糞-口途徑傳播，主要是食入含有卵囊的食物、水、接觸受污染的物品而感染。所以在預(yù)防上面應(yīng)該注意糞便的管理和個(gè)人的衛(wèi)生，防止病人、病畜和帶蟲者的糞便污染了食物和水以及其他的物品，避免食入和接觸這些受污染的物品，如接觸到要洗手消毒，保護(hù)好免疫力低下的人群，增強(qiáng)免疫力。

4 未來展望

在2004～2011年，在世界范圍內(nèi)報(bào)道的，隱孢子蟲是超過60%水傳播的原生動(dòng)物寄生蟲疾病爆發(fā)的原因，此后，受到醫(yī)學(xué)界的重點(diǎn)關(guān)注,國內(nèi)外的學(xué)者也做了大量的研究。但目前對(duì)于隱孢子蟲感染的人群或動(dòng)物沒有特別療效的藥物治療。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)簡易快速的隱孢子蟲病診斷試劑盒，通過基因型和基因亞型的分型工具從而更準(zhǔn)確的提高隱孢子蟲病檢測(cè)的效果。同時(shí)，著重研究有效的治療藥物和新一代抗隱孢子蟲病疫苗等方面。