寄生蟲病LAMP技術研究進展

李 慧，陳 苗，唐 莉，闞珍珍，李文超，顧有方

（安徽科技學院動物科學學院，安徽 鳳陽 233100）

近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展，新的核酸擴增技術不斷涌現(xiàn)。環(huán)介導等溫擴增技術，簡稱LAMP是利用4個特殊設計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA的新技術。該技術在1h內能擴增出109靶序列拷貝,擴增產(chǎn)物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環(huán)結構和多環(huán)花椰萊樣結構的DNA片段的混合物,電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜LAMP等溫擴增反應體系包含了內外引物、模板DNA、Bst DNA聚合酶、dNTP和緩沖液。其基本操作過程是將LAMP反應體系 (除 Bst DNA聚合酶)在95℃加熱5min后,冷卻,再加入8U Bst DNA聚合酶,在63%保溫60min,然后在高于80℃的溫度下加溫2min終止反應。LAMP與以往的核酸擴增方法相比，具有操作簡單,快速高效、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點。

寄生蟲病在人類傳染病中有著非常重要的影響。及時有效的寄生蟲病診斷是疾病防治的首要環(huán)節(jié)。寄生蟲病檢測手段有病原學、免疫學和分子生物學等。病原學檢查是常用的確診方法,但易導致漏診或誤診。免疫學檢測在敏感性、特異性方面比病原學法有所提高,但卻存在交叉反應、不能區(qū)分現(xiàn)癥患者或既往感染等問題。分子生物學方法在寄生蟲病檢測中敏感性和特異性比前兩者更高,同時也存在著一些不足,如操作繁瑣、儀器昂貴、擴增耗時等。因此,迫切需要一種敏感性和特異性高、操作簡便快速的方法用于寄生蟲感染檢測。LAMP是一種嶄新的DNA擴增方法,具有簡便、快速、特異性強等特點。目前該技術已經(jīng)應用于胚胎性別鑒定及多種病原體的檢測,國外已有用該法檢測寄生蟲病的相關報道。本文就該技術在寄生蟲方面的應用綜述如下。

1 華支睪吸蟲

華支睪吸蟲病在遠東地區(qū)盛行，是流行地區(qū)的一個主要健康問題。感染者如果不治療，可能會經(jīng)歷嚴重的并發(fā)癥，如膽結石形成，化膿性膽管炎，甚至膽管癌。慢性感染引起一些臨床表現(xiàn)，包括腹部或上腹不適，疲勞，黃疸，嘔吐，發(fā)熱和腹瀉。早期診斷和治療對預防嚴重并發(fā)癥是重要的，因此在診斷資源有限的流行地區(qū)，控制華支睪吸蟲需要簡單可靠的診斷方法。

華支睪吸蟲感染是華人、韓國、越南等東亞國家主要的公共衛(wèi)生問題之一，若不予以治療，會引起膽管癌。明確的診斷對于成功治療和預防流行地區(qū)的感染是重要的。由于肝吸蟲卵和微小腸吸蟲之間的形態(tài)相似性，糞便檢查它們有時會遺漏輕度感染的病例，并可能導致在物種水平上的錯誤識別。為了克服糞便檢查的診斷限制，ELISAs和PCR已經(jīng)被開發(fā)成為一種靈敏而特異的診斷方法，但是它們需要諸如熱循環(huán)儀和分光光度測定法之類的精密設備，這妨礙了這些技術在低資源地區(qū)的廣泛使用。LAMP測定可以在等溫條件（60～65℃）下進行;因此，簡單的水浴或加熱器就足以放大特定的DNA。此外，該檢測方法可以通過添加熒光染料目測檢測DNA擴增。將LAMP分析應用于從韓國的華支睪吸蟲病地區(qū)采集的人糞便樣品。使用Kato-Katz方法和實時PCR作為參考標準，使用顯示一致結果的樣品，LAMP測定顯示出97.1%（95%CI，90.1～99.2） 的靈敏 度和 100%（95%CI，92.9-100）特異性。由于對糞便樣品中的C.sinensis DNA進行了靈敏而特異性的檢測，LAMP檢測方法可以在現(xiàn)場實驗室中應用，作為診斷和流行病學調查華支睪吸蟲的有力工具。

2 日本血吸蟲

日本血吸蟲寄生動物門靜脈的小血管內，引起的對宿主產(chǎn)生機械損傷，并引起復雜的免疫病理學反應。降低血吸蟲病流行程度和感染強度尤其重要，準確的診斷試驗在血吸蟲病患者管理和控制中起著關鍵的作用。

診斷是控制血吸蟲病的核心。目前可用的診斷方法包括隨訪化療。寄生蟲學技術（Kato-Katz方法）和抗體檢測分析（ELISA和IHA）并不理想。Lier等人報道實時PCR檢測在豬模型中檢測低強度日本血吸蟲感染。隨后，這種方法被用于臨床試驗。這種實時熒光定量PCR檢測方法比顯微鏡方法檢測到的陽性糞便樣本稍多，但在血清和尿樣中一直呈陰性。據(jù)我們所知，大多數(shù)以PCR為基礎的方法都集中在檢測糞便中特異性的Schistosoma DNA上，所有這些方法都可以看作是對糞便檢查方法的改進，一般來說，血清和尿液樣本比糞便樣本更容易獲得并且在許多人群中被接受，血吸蟲DNA將平均分布在患者的整個血清中，因此，血清樣本中的血吸蟲DNA的檢測在現(xiàn)場條件下會更準確。

與PCR不同，LAMP分析不需要通過熱循環(huán)或通過電泳檢測的擴增子進行擴增循環(huán)。以前的研究建立了針對SjR2的LAMP分析方法，該方法能夠檢測到0.08 fg日本血吸蟲DNA，比普通PCR分析法靈敏度高104倍。LAMP測定的效用首先在具有非常低的感染強度（EPG=16）的兔子模型中評估。在評估循環(huán)介導等溫擴增（LAMP）法檢測光強度感染或假陰性患者的效用，以及評估患者的化療有效性實驗中，針對高度重復的日本血吸蟲反轉錄轉座子SjR2目前的研究表明，LAMP分析是敏感的，具體的和可負擔得起的，這將有助于通過有針對性的治療來減少血吸蟲病的傳播，特別是那些糞檢陰性但可能仍然感染的人。LAMP分析可能為血吸蟲病控制和消除策略提供了一個潛在的工具，特別是對于與當前流行的情況相一致的輕度感染的病例。

3 弓形蟲

感染弓形蟲寄生蟲可以通過食用含有組織囊腫的生肉，或被卵囊污染的食物和水來獲得。急性感染可導致孕婦經(jīng)胎盤傳播給胎兒，嚴重損害胎兒，最終導致新生兒畸形，神經(jīng)損傷，失明或死胎。弓形體病的診斷對控制疾病是重要的。

實驗室診斷歷來依賴于以下幾種方式之一的急性弓形蟲感染。例如，寄生蟲學和組織學方法是從血液或體液例如組織培養(yǎng)物中分離出速殖子階段。作為PCR的分子生物學方法是擴增特定的弓形蟲基因或DNA片段。作為弓形蟲感染的診斷方法，也已經(jīng)開發(fā)了修改的凝集試驗，免疫色譜試驗和實時PCR法。盡管取得了這些進展，但由于血清學方法費時，并且由于寄生蟲抗原制備期間的額外寄生蟲物質可能會出現(xiàn)假陽性結果，并且有時不能區(qū)分早期感染，所以弓形蟲感染的診斷仍不令人滿意。雖然最近開發(fā)了基于PCR的技術，但是由于反應時間長和設備的昂貴成本而受到限制。因此，我們仍然有必要開發(fā)弓形蟲的成本效益和快速檢測方法。LAMP分析也被用于檢測弓形蟲，基于人類血液樣本的SAG1，SAG2和B1基因診斷弓形體病。最近，AF146527片段（GenBank登錄號AF146527）是弓形蟲的200～300倍重復的529bp片段，已被用于開發(fā)診斷非常敏感和特異性的PCR，LAMP方法被證明是非常具體和靈敏的檢測剛地弓形蟲在DNA樣本和人體血液樣本。此外，LAMP方法在檢測弓形蟲方面比常規(guī)PCR等其他方法敏感得多。

4 瘧原蟲

由于許多分子工具在技術上具有挑戰(zhàn)性并需要復雜的設備，因此它們的使用受到限制。已經(jīng)描述了等溫DNA擴增測定，如環(huán)介導的等溫擴增。這些測定法非常適合于現(xiàn)場使用，因為反應在單一溫度下進行，所以它們不需要熱循環(huán)儀來進行測試。幾項研究已經(jīng)報道了使用LAMP分析瘧原蟲檢測。最近，報道了用LAMP（NINA-LAMP）進行瘧疾寄生蟲檢測的非儀器化核酸擴增。

已經(jīng)研究了用于LAMP產(chǎn)品讀數(shù)的比色法，取得了一些成功。MG是傳統(tǒng)上用作絲綢，皮革和紙張等材料的染料的有機化合物，MG染料被稱為基因組指數(shù)擴增反應（GEAR）測定的等溫擴增測定。MG-等溫擴增分析（LAMP和GEAR）在DNA擴增時產(chǎn)生綠/藍色，而負樣品（無擴增）是無色的，因此不需要特殊的自動閱讀器。顯示使用MG染料的LAMP和GEAR測定產(chǎn)物的這種視覺評估是可重復的，穩(wěn)健和一致的。MG-LAMP分析的最有吸引力的特征是它可以潛在地用于篩選大量樣品，因為可以使用保持恒定溫度的加熱塊進行分析。研究中表示使用瘧原蟲特異性MG-LAMP分析證明準確和敏感的瘧疾寄生蟲檢測。

5 隱孢子蟲

賈第蟲和隱孢子蟲是環(huán)介導等溫擴增（LAMP）是開發(fā)的用于DNA擴增的技術，其對DNA污染物的效率和不敏感性優(yōu)于聚合酶鏈式反應（PCR）。在奧爾杜省，黑海中部，土耳其共采集了70個水樣，包括水龍頭，河流，噴泉和井水，并調查了隱孢子蟲卵囊的檢測。通過顯微鏡直接篩選隱孢子蟲卵囊的免疫熒光檢測，然后通過環(huán)介導等溫擴增（LAMP）和巢式聚合酶鏈反應（PCR）提取DNA進行分子檢測。70個水樣中有18個（25.7%）水樣被發(fā)現(xiàn)為隱孢子蟲屬。通過免疫熒光試驗發(fā)現(xiàn)19例（27.1%）LAMP陽性。在任何被調查的水樣中都沒有產(chǎn)生巢式PCR產(chǎn)物?？偣搽S機選擇16個水樣，加入10個隱孢子蟲卵囊以測試所用方法的效率。所有的樣品都被LAMP發(fā)現(xiàn)為隱孢子蟲DNA的陽性，而在16個檢測的加標樣品中只有7個（43.75%）的巢式PCR檢測為陽性。

6 細粒棘球蚴

由細粒棘球蚴引起的囊狀棘球蚴病是導致廣泛胃腸疾病的原生動物寄生蟲。這些致病原生動物暴發(fā)中有90%是通過水發(fā)生的。從公共衛(wèi)生角度來說具有重要的重要性，并且也具有顯著的社會經(jīng)濟影響。

對常規(guī)的實驗室診斷和監(jiān)測，DNA方法有一個實質性的缺點，即常規(guī)PCR的敏感性可能受到糞便樣品中存在的抑制因子的嚴重影響。一種基于環(huán)介導等溫擴增（LAMP）的有效的監(jiān)測工具，用于檢測在現(xiàn)場收集的陽性犬糞便樣品。采用LAMP，PCR和copro-ELISA分析，現(xiàn)場采集的糞便標本陽性率分別為12.6%，1.6%和2.1%。從對照組獲得的所有樣品都是陰性的。與常規(guī)PCR相比，LAMP測定法提供了88.8%的特異性和100%的靈敏度。

7 結語

LAMP方法在臨床樣品處理中顯示出更高的靈敏度和有效率。盡管不同的LAMP檢測方法的檢測率不同，但LAMP方法在特異性，快速性，靈敏度方面仍然具有優(yōu)勢，并且易于在獸醫(yī)和醫(yī)學領域廣泛應用。需要做更多的工作來進一步改進LAMP方法寄生蟲病的診斷方法，甚至其他病原體。其臨床快速，可靠的診斷在發(fā)展中國家尤其是基層有重要意義，如能廣泛運用將對我國寄生蟲防控帶來巨大效益。