動(dòng)物炭疽的診斷方法

于友水

（哈爾濱市阿城區(qū)畜牧站，黑龍江 哈爾濱 150300）

本病發(fā)病急，病程短，臨床診斷困難。調(diào)查該地區(qū)有關(guān)炭疽發(fā)生及尸體處理情況，有助于本病的診斷，但真正確診必須依靠細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)診斷。

病死畜若有炭疽可疑，切不可剖檢?？杉舳庖恍K，然后局部做適當(dāng)處理（如燒烙），或用消毒棉棒蘸天然孔流出的血液少許，置滅菌試管中送檢。

1 鏡檢

鏡檢診斷炭疽有重要價(jià)值，但必須采取發(fā)病期及剛剛死亡動(dòng)物的血液或其他材料制成涂片，用多色性美藍(lán)、瑞氏染液或姬姆薩染液染色。如見有單個(gè)、成對(duì)或3～5個(gè)短鏈狀大桿菌，菌端鈍圓，連接端呈刀切或竹節(jié)狀的菌體，外有明顯的莢膜，結(jié)合臨床表現(xiàn)，即可確診。

2 培養(yǎng)檢查

本菌在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上可以形成表面粗糙、邊緣呈卷發(fā)狀的典型菌落，釣此菌落菌于肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，肉湯應(yīng)澄清，管底有絮狀沉淀，輕搖如絲狀升起，本菌無運(yùn)動(dòng)性，這些均為本菌的生長(zhǎng)特點(diǎn)。

3 動(dòng)物試驗(yàn)

因動(dòng)物試驗(yàn)檢查本菌的致病力也是確定炭疽桿菌的重要方法。病料5～10倍滅菌生理水乳劑或肉湯培養(yǎng)物，對(duì)小白鼠接種0.1～0.2mL，豚鼠0.2～0.3mL，皮下注射。接種后置鐵絲籠或鼠罐中，嚴(yán)格管理。動(dòng)物一般在18～72h死于敗血病。死亡動(dòng)物在嚴(yán)格消毒措施下進(jìn)行剖檢，取心血、肝、牌涂片、壓片或抹片鏡檢，可見滿布有莢膜的短鏈狀的炭疽桿菌，如果進(jìn)行分離培養(yǎng)，仍可見到前述典型的炭疽菌落。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尸體應(yīng)即焚毀，所用的一切用具、器械等應(yīng)絕對(duì)嚴(yán)格地進(jìn)行消毒滅菌處理。

4 血清學(xué)檢驗(yàn)

4.1 炭疽環(huán)狀沉淀反應(yīng)

又稱阿司口里氏反應(yīng)。當(dāng)病料腐敗不能分離出炭疽桿菌或尸體嚴(yán)重污染不能做細(xì)菌檢查時(shí)，此反應(yīng)仍很敏感。這是由于死于炭疽的動(dòng)物組織中含有炭疽桿菌菌體成分，而炭疽菌的菌體抗原對(duì)熱和腐敗有強(qiáng)大的抵抗力。

本反應(yīng)是將含有抗原的全透明的浸出液，重疊于炭疽沉定素血清（抗體）上，在兩液接觸面發(fā)生白色沉淀環(huán)，故稱炭疽環(huán)狀沉淀反應(yīng)。

4.1.1 抗原（沉淀原）的制備：

（1）動(dòng)物臟器抗原：將可疑檢樣數(shù)克，剪碎、搗碎或研碎，加5～10倍生理鹽水浸漬，再置沸水中煮沸30min，用濾紙或中性石棉過濾，透明的濾液即為沉淀原。

（2）皮張抗原：取硬幣大小的皮膚小塊（可若干份放在一起），121℃高壓滅菌30min。然后剪碎、稱重，加5～10倍量的0.3%石炭酸生理鹽水，室溫浸泡18～24h，用濾紙或中性石棉過濾，透明液體即為沉淀原。

4.1.2 反應(yīng)操作：取炭疽沉淀反應(yīng)小管1支，用毛細(xì)吸管吸取生物制品廠生產(chǎn)的炭疽沉淀血清0.3～0.5mL（視管大小面定，裝入管1/3～1/2）。然后用另一支毛細(xì)吸管吸取等量自己制備的沉淀原，置于炭疽沉淀素血清之上。要沿管壁慢慢流入，避免打破接觸面。

同時(shí)應(yīng)設(shè)3支對(duì)照管。即：

（1）陽(yáng)性對(duì)照：標(biāo)準(zhǔn)炭疽沉淀原+炭疽沉淀素血清；

（2）陰性對(duì)照：標(biāo)準(zhǔn)炭疽沉淀原+健康動(dòng)物正常血清（檢測(cè)沉淀原是否標(biāo)準(zhǔn)）；

（3）陰性對(duì)照：生理鹽水+炭沉淀素血清（檢測(cè)炭疽沉淀素血清是否標(biāo)準(zhǔn)）。

4.1.3 結(jié)果判定 臟器抗原放置37℃溫箱，1～2min觀察結(jié)果，皮張抗原10～15min觀察結(jié)果。兩液接觸面出現(xiàn)一清晰白色環(huán)者為陽(yáng)性反應(yīng)；在兩液接觸面出現(xiàn)模糊不清的疑似白色環(huán)者為可疑，應(yīng)重做；在兩液接觸面無白色環(huán)者為陰性反應(yīng)。

4.2 熒光抗體檢查法

炭疽莢膜熒光抗體檢查法是一種特異性強(qiáng)、檢出率高、簡(jiǎn)便快速的方法。將病料均勻涂于載玻片上，干燥、火焰固定后，滴加用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗炭疽血清熒光抗體，置濕盒內(nèi)作用30min后傾去載片上的熒光抗體，載片浸于緩沖鹽水內(nèi)3min，再移入另一緩沖鹽水內(nèi)3min，取出干燥，滴加緩沖甘油并覆以蓋片，用熒光顯微鏡檢查。陽(yáng)性者，見有炭疽莢膜桿菌，菌體明顯膨大，菌體周圍呈明顯的黃綠色熒光，亮度強(qiáng)，容易辨認(rèn)。

4.3 串珠試驗(yàn)

炭疽桿菌不產(chǎn)生青霉素酶，對(duì)青霉素高度敏感，接觸青霉素時(shí)發(fā)生形態(tài)變異。在0.5IU/mL青霉素培養(yǎng)基中，菌體膨脹呈圓形，呈明顯的串球狀，而炭疽類似菌則不呈串珠反應(yīng)，這一點(diǎn)在炭疽菌與其類似菌鑒別上極為重要。

（1）液體培養(yǎng)法：取新鮮可疑培養(yǎng)物接種于1.8mL肉湯中，同時(shí)按5U/mL加入青霉素0.2mL，使青霉素的最終濃度為0.5IU/mL。另取2mL肉湯只加培養(yǎng)物不加青霉素做對(duì)照。37℃水浴或溫箱1～1.5h，取出加20%福爾馬林0.25mL，固定10min后做涂片檢查，炭疽桿菌一般在1～1.5h出現(xiàn)明顯串珠狀，其他細(xì)菌則不呈串珠狀。

（2）固體培養(yǎng)法：取普通瓊脂加熱融化，按0.5IU/mL加入青霉素，充分搖勻，倒入平皿，其厚度為1mm左右，凝后，用滅菌刀切成蓋片大小的方塊，平放在潔凈的載片上，取1鉑耳培養(yǎng)4～12h的可疑菌液接種在瓊脂片上，把載片放在平皿中，皿中放一小塊濕棉球，蓋上皿蓋，37℃培養(yǎng)2～4h，加蓋片，用低倍和高倍顯微鏡檢查，同時(shí)用不加青霉素的瓊脂片作為對(duì)照。鏡檢時(shí)可見大而圓相連成串珠狀者為陽(yáng)性。