植物凝集素檢測方法的研究進(jìn)展

冷 艷，孫憲迅，王 璐，徐 媛，陳禪友

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056）

0 引言

植物凝集素（Lectin）是植物界中存在的非免疫來源蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中含有一個或一個以上能夠可逆結(jié)合到特異單糖或多糖上的非催化結(jié)構(gòu)域［1］。最早發(fā)現(xiàn)植物凝集素的是Stillmark等人，他們在1888年從萬麻籽的提取物中發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)，該物質(zhì)能使動物紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象。隨后人們又陸續(xù)從其他植物中發(fā)現(xiàn)了類似的物質(zhì)，并證明了該物質(zhì)在自然界中是普遍存在的。正是由于此類物質(zhì)能使動物紅細(xì)胞發(fā)生凝集，它們也被統(tǒng)稱為血細(xì)胞凝集素［2-6］。目前已發(fā)現(xiàn)的凝集素有1 000多種，且這些凝集素主要存在于植物的種子和組織中。由于植物凝集素具有生物活性，使得其在食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域受到研究人員的廣泛關(guān)注。近年來對于植物凝集素檢測方法的研究也取得了一定的進(jìn)展。

1 植物凝集素的分類

由于不同種類和來源的植物凝集素在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物活性、糖基結(jié)合特異性等方面存在明顯差異，因此可根據(jù)這些不同的特性，將植物凝集素進(jìn)行具體的分類。如根據(jù)植物凝集素特異性結(jié)合不同種類的糖基，可分為：N-乙酰氨基半乳糖凝集素、D-甘露糖或D-葡萄糖凝集素、N-乙酰氨基葡萄糖凝集素、D-半乳糖凝集素、L-巖藻糖凝集素及唾液酸凝集素；根據(jù)植物凝集素分子結(jié)構(gòu)的不同，可分為全凝集素（hololectin）、部分凝集素（merolectin）、嵌合凝集素（chemerolectin）和超凝集素（superlectin）［7-9］。

2 植物凝集素的生物活性

2.1 植物天然的防御蛋白

植物凝集素在植物防御體系中起著非常重要的作用，這主要是由于植物凝集素具有和單糖或多糖發(fā)生特異性可逆結(jié)合的能力，尤其是對在植物中不常見或根本不存在的寡聚糖具有很高的親和力［10］。例如，豆科植物凝集素中的幾種可以與細(xì)菌肽聚糖的組成成分N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰胞壁酸等發(fā)生作用，從而起到防治細(xì)菌侵害的作用［11］。幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素可以與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)或無脊椎動物外骨骼中的寡糖結(jié)合，從而防治真菌或害蟲對植物的侵害。很多單子葉植物中的甘露糖凝集素對動物（包括人）的反轉(zhuǎn)錄病毒具有抑制作用（Peumans）。植物凝集素的這一生物學(xué)特性在植物的病蟲害防治研究領(lǐng)域越來越被研究人員關(guān)注。

2.2 植物凝集素的抗?fàn)I養(yǎng)作用

植物凝集素是一類抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有抗?fàn)I養(yǎng)作用，主要表現(xiàn)為：①阻礙動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，如大豆凝集素可以導(dǎo)致非血紅素鐵和脂肪的吸收障礙，增加內(nèi)源氮的排出，從而降低了氮在動物體內(nèi)的留存率［7，12］；②對動物生長的抑制作用，且該抑制作用隨動物種類、年齡和攝入的量等因素而有所不同，例如大豆凝集素對反芻動物的生長影響遠(yuǎn)小于其對單胃動物的影響［13］；③影響腸道功能，大量植物凝集素可與大鼠的小腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致上皮細(xì)胞微絨毛萎縮、刷狀緣膜紊亂，使得上皮細(xì)胞的正常功能和發(fā)育能力下降［7］；④影響胰腺的結(jié)構(gòu)和功能，引起胰腺增生［14-16］；⑤刺激黏膜下的肥大細(xì)胞脫粒，從而引發(fā)過敏反應(yīng)［17-20］。同時，某些植物凝集素進(jìn)入動物體內(nèi)（尤其是兒童和幼齡動物），能產(chǎn)生較強的IgE抗體，會加重機體過敏反應(yīng)的發(fā)生［21］。

3 植物凝集素的檢測方法

研究人員一直都在潛心研究植物凝集素的檢測方法，目前的相關(guān)檢測方法根據(jù)檢測原理的不同可分為三大類。

3.1 紅細(xì)胞凝集法

植物凝集素具有紅細(xì)胞凝集作用，即凝集素與紅細(xì)胞表面的糖結(jié)合位點發(fā)生作用，使得凝集素分子在紅細(xì)胞之間形成多重交叉的橋狀結(jié)構(gòu)，從而造成紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象，同時凝集素的凝集活力（效價）與其量的多少呈線性關(guān)系。目前利用血凝反應(yīng)檢測植物凝集素活性的方法是應(yīng)用最為廣泛的植物凝集素檢測方法［19，22］。

測定凝集素活性的方法有96孔血凝板法、試管法、Liener法等，其中96孔血凝板法被廣泛應(yīng)用，該方法將動物紅細(xì)胞（兔、豬、羊、人等動物的紅細(xì)胞）配制成一定濃度的紅細(xì)胞懸液，再將其加入到經(jīng)過一定比例稀釋后的凝集素溶液中，放置一段時間后，可通過肉眼觀察或比色測定植物凝集素的凝血活性［19，23-24］。試管法是將各待測樣與細(xì)胞懸液混勻，于37℃下培養(yǎng)1.5 h的肉眼觀測血凝程度，然后在2 000 r/min下離心，棄去上清液。將裝有血凝細(xì)胞的試管于恒溫干燥箱中，105℃下干燥至恒重，冷卻、稱重，得干重量，以其多少評價血凝程度的高低［25］。

紅細(xì)胞凝集作用受到凝集素自身特點的影響，如糖結(jié)合位點的數(shù)量和分子大小；同時也受到細(xì)胞表面特性的影響，如受體部位的可及性或細(xì)胞膜的流動性。同時也受到外部環(huán)境的影響，如溫度、細(xì)胞濃度等，此種檢測方法可對植物凝集素進(jìn)行定性或半定量的檢測［26］。

科學(xué)家們?yōu)榱诉M(jìn)一步提高凝集反應(yīng)的靈敏度和準(zhǔn)確度，進(jìn)行了多次改進(jìn)，比如將凝集反應(yīng)與分光光度法、激光濁度測定法、光散法和粒子計數(shù)法等方法相結(jié)合。紅細(xì)胞凝集法所使用的紅細(xì)胞可以是新鮮的動物血紅細(xì)胞或者是新鮮的人血紅細(xì)胞，也可以使用經(jīng)過修飾后的紅細(xì)胞，凝集素對于不同來源的血紅細(xì)胞（如不同血型、不同動物的血紅細(xì)胞等）表現(xiàn)出不同的凝集效果。在實驗過程中，通過對紅細(xì)胞的修飾，提高紅細(xì)胞對凝集素的靈敏度，可以較好地解決這個問題。比如，經(jīng)過一些蛋白酶（如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等）修飾后的紅細(xì)胞對大豆凝集素的靈敏度顯著增強。2006年，劉琳娜通過大豆凝集素與胰酶修飾紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)實驗證實，經(jīng)過胰蛋白酶處理后，兔紅細(xì)胞對大豆凝集素的靈敏度提高了4倍，豬紅細(xì)胞對大豆凝集素的敏感度提高了6～8倍，而且，原本不會發(fā)生凝集反應(yīng)的雞紅細(xì)胞在胰酶修飾后可發(fā)生凝集現(xiàn)象［27］。紅細(xì)胞凝集法具有易操作、耗時少等優(yōu)點，能夠在較短的時間內(nèi)完成對大量樣品的檢測，在植物凝集素含量的初步測評中起著重要的作用，但是只有具有凝集活性的多價態(tài)的凝集素才可以使用該反應(yīng)進(jìn)行檢測，對于在特殊條件下的單體或者活性功能片段因不能使紅細(xì)胞發(fā)生凝血反應(yīng)而無法使用該方法檢測。

3.2 糖復(fù)合物法

利用植物凝集素能特異性結(jié)合糖、糖蛋白或糖復(fù)合物的特性對植物凝集素進(jìn)行檢測的方法，即糖復(fù)合物法。該方法最早是將糖復(fù)合物標(biāo)記上放射性同位素后，與植物凝集素在一定溫度下孵育，由于糖復(fù)合物與凝集素的多價糖基結(jié)合位點發(fā)生相互作用，且生成的結(jié)合物在高鹽濃度下易產(chǎn)生沉淀，而后借助離心或過濾等方法將結(jié)合物分離出來。通過檢測沉淀中放射性標(biāo)記的強度，可計算出標(biāo)記結(jié)合物的量以及結(jié)合常數(shù)，也可利用抑制劑或競爭性底物對沉淀放射性強度的影響程度，計算出抑制劑或競爭性底物的抑制常數(shù)或結(jié)合常數(shù)，再通過對這些抑制劑的抑制常數(shù)的比較可確定待測凝集素的專一性或結(jié)合活性，從而得出其含量［28］。根據(jù)Pusztai等建立的方法，楊麗杰等［29］利用玻璃板為支持體，在1%的瓊脂糖凝膠中加入半乳糖，緩沖液為pH 8.6的0.07 mol/L Tris-甘氨酸溶液，成功地對黑龍江幾個大豆品種中的凝集素進(jìn)行了定性和定量分析。

此外，為了克服紅細(xì)胞種類對凝集效果的影響，研究者提出一種新的方法，該方法是將具有與待測凝集素特異性結(jié)合位點的糖復(fù)合物，通過共價連接的方式結(jié)合聚苯乙烯膠粒表面，以此來替代紅細(xì)胞，此檢測方法的其他步驟與紅細(xì)胞凝集反應(yīng)基本相同［30］。這種方法避免了使用新鮮紅細(xì)胞帶來的不便和影響，還提供了測定凝集素糖結(jié)合特異性更為簡便的方法。

3.3 抗原抗體免疫法

植物凝集素是一種蛋白質(zhì)，它可以作為抗原誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。由此可以采用一些免疫學(xué)的方法來測定植物凝集素，如采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）、火箭免疫電泳等方法或放射性免疫分析法（RIA）進(jìn)行定量分析［28，31］。這些免疫學(xué)方法都只能檢測植物凝集素的免疫學(xué)性質(zhì)，而不能反映植物凝集素的生物學(xué)功能活性，即不能準(zhǔn)確地反映出凝集素對紅細(xì)胞的凝集能力及其與腸壁細(xì)胞的結(jié)合能力和在體內(nèi)潛在的毒性作用。為了解決這個問題，研究人員建立了功能性凝集素免疫測定技術(shù)，該技術(shù)可對待測凝集素的生物毒性及其在動物體內(nèi)發(fā)生的生物學(xué)作用進(jìn)行更確切的評價，如活性凝集素免疫分析法（FLIA）（將凝集素與包被在微滴定平板中的小腸刷狀緣細(xì)胞膜相結(jié)合）、刷狀緣凝集素凝集分析法（BBLAA）等［32-33］。

目前的植物凝集素免疫學(xué)檢測方法能夠有效地檢測出具有免疫活性的植物凝集素，但由于這些方法中所使用的抗體大多為抗凝集素的多克隆抗體。因多克隆抗體制備的特點，其成分較為復(fù)雜，使得現(xiàn)有的植物凝集素免疫學(xué)檢測方法在使用的范圍和標(biāo)準(zhǔn)化程度上受到了一定的限制。比如不同動物種類和不同批次制備可能造成多克隆抗體樣品成分和效價不同等，這些因素都會影響檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性。利用細(xì)胞融合技術(shù)獲得的單克隆抗體具有純度高、特異性好、重復(fù)性好等特點，越來越多地被應(yīng)用到免疫學(xué)檢測中。近幾年，植物凝集素的檢測方法中出現(xiàn)了基于單克隆抗體的功能性植物凝集素免疫測定技術(shù)的研究。張海全等［34］以兔紅細(xì)胞膜作為載體，大豆凝集素純品作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，植物凝集素的單克隆抗體作為檢測抗體，建立了檢測大豆凝集素含量的功能性酶聯(lián)免疫學(xué)方法。

4 展望

隨著食品、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥對植物資源的開發(fā)和利用，分析植物中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)——植物凝集素對其資源選育和利用以及食品安全具有重要的現(xiàn)實意義，建立靈敏度更高、重復(fù)性更好、操作性更簡便的植物凝集素檢測方法必將成為今后的發(fā)展方向。由于植物凝集素的檢測難度高于一般生化物質(zhì)，因而目前的各種檢測方法尚存在檢測穩(wěn)定性不高、靈敏度欠佳、無法實現(xiàn)真正意義上的高通量等問題。今后，國內(nèi)外的植物凝集素檢測方法的研究將向快速、便捷和高通量等方向發(fā)展，未來植物凝集素的檢測方法必將是多維而全面的。例如，將多種現(xiàn)有的檢測方法進(jìn)行聯(lián)用，從而達(dá)到準(zhǔn)確、高效檢測的目的。另一方面，植物凝集素檢測方法研究中，也將會應(yīng)用到更多的新技術(shù)，未來的發(fā)展方向?qū)性诨蚬こ炭贵w的使用和改造、納米技術(shù)的應(yīng)用和多通路自動化檢測方案的實現(xiàn)等方面的創(chuàng)新和改造，從而獲得更加靈敏、高效的檢測效果。