豬肺炎支原體主要保護(hù)性抗原的研究進(jìn)展

王文秀，王寶琴，徐晴晴，劉 博，張 艷

( 1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院, 山東 濱州 256600; 2. 濱州學(xué)院生物工程學(xué)院, 山東 濱州 256600;3.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 海南 海口 571100)

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是豬支原體肺炎(Mycoplsamal pneumonia of swine，MPS)的原發(fā)性病原，廣泛流行于世界各地，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。豬支原體肺炎又稱豬地方流行性肺炎(porcine enzootic pneumonia，PEP)，我國(guó)俗稱豬喘氣病[1]。MPS主要癥狀為咳嗽和氣喘，病變的主要特征是肺的尖葉、心葉、中間葉和膈葉前緣呈肉樣和蝦肉樣實(shí)變[2]。

Mhp感染豬體后最初黏附于呼吸道纖毛表面，隨后逐漸蠶食纖毛，直至纖毛大面積或全部脫落，纖毛脫落后，進(jìn)入呼吸道的異物及器官黏膜產(chǎn)生的分泌物無(wú)法排出而沉降到支氣管末端及肺泡中，逐漸形成肺實(shí)變，最終使肺臟功能遭到破壞，出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀[3]。MPS本身致死率不高，但誘發(fā)的豬呼吸道病綜合征(Porcine Respiratory Disease Comples，PRDC)的其他傳染病，特別是免疫抑制性疾病，如豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV-2)等往往導(dǎo)致豬嚴(yán)重死亡，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[4-5]。

Mhp對(duì)培養(yǎng)要求很高，在體外分離培養(yǎng)比較困難，目前完全測(cè)序的豬肺炎支原體共有4株(232株、7448株、J株、168株)，各株基因組全長(zhǎng)約900 kb，含有約700個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因[6]，其中約三分之一的基因編碼菌體表面蛋白，但是目前僅有小部分蛋白的表達(dá)和表面定位有所研究和證實(shí)[8]。本文圍繞Mhp部分黏附因子、膜蛋白及細(xì)胞質(zhì)蛋白等主要保護(hù)性抗原蛋白進(jìn)行綜述，為MPS疾病診斷、監(jiān)測(cè)和相關(guān)疫苗研究提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)該病的預(yù)防和控制具有重要指導(dǎo)意義。

1 黏附因子

豬肺炎支原體侵入呼吸道后，識(shí)別呼吸道黏膜纖毛細(xì)胞的特異性受體，并在呼吸道繁殖，特異性黏附在豬呼吸道纖毛上，定殖于宿主細(xì)胞受體，為致病的關(guān)鍵因素，該過(guò)程離不開(kāi)黏附因子的功能[9]。Mhp與豬呼吸道纖毛的黏附是多個(gè)黏附因子共同作用的結(jié)果，黏附機(jī)制還沒(méi)得到證實(shí)。近幾年，關(guān)于豬肺炎支原體黏附因子方面的研究有較多報(bào)道，發(fā)現(xiàn)黏附因子不但能夠黏附豬呼吸道纖毛，而且還具有結(jié)合肝磷脂、纖連蛋白和血纖維蛋白溶酶原等功能，這些功能與豬肺炎支原體致病過(guò)程息息相關(guān)[10]。目前，已鑒定出多個(gè)黏附因子，主要有：P97蛋白、P102蛋白、P116蛋白、P216蛋白、P146蛋白、P159蛋白、Mhp107蛋白、Mhp271蛋白等，這些黏附因子除P159蛋白外，都屬于P97/9102雙基因操縱子家族。

1.1 P97蛋白

P97蛋白是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的Mhp表面黏附因子，含有R1和R2兩個(gè)重復(fù)區(qū)域。R1區(qū)具有Mhp表面纖毛結(jié)合位點(diǎn)和主要抗原識(shí)別位點(diǎn)，它既可以作為主要抗原決定簇使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)也可以發(fā)揮纖毛的黏附功能，R2區(qū)不能黏附于支氣管纖毛表面，可能與黏附宿主上皮細(xì)胞外的機(jī)制相關(guān)[11]。R1區(qū)含有9個(gè)以上的AAKPV/E串聯(lián)基序，不同Mhp菌株R1區(qū)AAKPV/E的重復(fù)數(shù)量不同，232株有15個(gè)重復(fù)，168株有11個(gè)重復(fù)，J株有9個(gè)重復(fù)，7448株有10個(gè)重復(fù)[12]。

P97黏附因子作為一種免疫顯性抗原，引發(fā)的免疫反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于其他抗原，F(xiàn)eng等[13]以P97 R1原核表達(dá)產(chǎn)物作為包被抗原建立SIgA3ELISA檢測(cè)方法，以鼻試子為檢測(cè)樣本，以做出Mhp的早期診斷，該檢測(cè)方法的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性均高于94%，并且該檢測(cè)方法能夠從接種豬肺炎支原體疫苗豬中區(qū)分出自然感染豬，所以P97蛋白在MPS早期診斷方面具有非常重要的研究?jī)r(jià)值。

由于P97抗體在體外能夠阻止病原對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的黏附作用，所以P97黏附蛋白是用于開(kāi)發(fā)亞單位疫苗較好的候選抗原。Barate等[14]通過(guò)原核表達(dá)并純化R1重組蛋白(rR1)、R1R2重組蛋白(rR1R2)及大腸桿菌不耐熱毒素B單位融合蛋白(rLTBR1、rLTBR1R2)后，分別加入IMS 1113佐劑制成亞單位疫苗后免疫雌性BALB/c小鼠，結(jié)果表明每個(gè)重組蛋白均能誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)R1的特異性體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答，其中rLTBR1R2融合蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答最快；通過(guò)檢測(cè)血清和支氣管肺泡灌洗發(fā)現(xiàn)每個(gè)重組蛋白均能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞反應(yīng)，并且重要的是針對(duì)R1特異性的Th2細(xì)胞反應(yīng)與自然感染和疫苗免疫相似。Okamba等[15]等構(gòu)建P97 C端重組腺病毒載體疫苗(rAdP97c)，在豬上應(yīng)用發(fā)現(xiàn)能夠誘發(fā)豬機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的P97特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且能夠降低攻毒試驗(yàn)后肺損傷程度；未免疫組肺損傷程度高達(dá)(45.8±11.5)%，而免疫組的肺損傷能夠降低至(18.5±9.6)%；其次rAdP97c疫苗能夠顯著降低炎癥反應(yīng)的程度和減少豬呼吸道Mhp的數(shù)量，并且能夠提高豬日增重；未免疫組日增重(0.568±0.104)kg，而免疫組能夠達(dá)到(0.672±0.068)kg。但是與商品化疫苗相比，僅rAdP97c疫苗引起的免疫應(yīng)答還不夠完善，這表明其實(shí)具有免疫保護(hù)作用的抗原遠(yuǎn)非P97黏附因子一個(gè)，所以在新型疫苗的研究上其他能夠引起免疫應(yīng)答的保護(hù)性抗原還有待更深一步研究與開(kāi)發(fā)。王凱等[16]構(gòu)建的P97重組腺病毒Ad3P97具有良好的免疫原性，也能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生特異性抗體，但未對(duì)免疫劑量、免疫時(shí)間及免疫保護(hù)期進(jìn)行研究。

1.2 P102

豬肺炎支原體P102蛋白由Mhp182基因編碼，大小約102 kDa，由蛋白酶解加工成位于表面但功能未知的N端(P60，60 kDa)和C端(P42，42 kDa)。Mhp182與編碼P97蛋白的Mhp183基因共用一個(gè)操縱子，P102蛋白可能具有潛在的吸附纖毛能力或輔助P97蛋白黏附的作用[17]。

Seymour等[18]發(fā)現(xiàn)P102重組蛋白(rP102)在生理學(xué)上能結(jié)合血纖維蛋白溶酶原，增加由組織纖溶酶原激活物(tissue-specific plasminogen activator，tPA)激活血纖維蛋白溶酶的敏感性，P60重組蛋白(rP60)和P42重組蛋白(rP42)在生理學(xué)顯著水平上也能有效的結(jié)合血纖維蛋白溶酶原。Mhp表面結(jié)合的血纖維蛋白溶酶原由tPA激活變?yōu)檠w維蛋白溶酶后才能夠降解纖維蛋白原，Mhp感染豬的呼吸道纖毛上能夠檢測(cè)到血纖維蛋白溶酶原，在支氣管肺泡灌洗液中能夠檢測(cè)到較高水平的血纖維蛋白溶酶，研究還發(fā)現(xiàn)rP102能夠促進(jìn)黏附豬腎臟上皮樣細(xì)胞。

1.3 P116

P116蛋白由Mhp108基因編碼，是P102蛋白橫向同源物，蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)P116蛋白可以表達(dá)全長(zhǎng)，也可以表達(dá)17～70 kDa不同大小的片段，當(dāng)去除P116蛋白C端結(jié)構(gòu)域時(shí)P116蛋白將失去結(jié)合血纖維蛋白溶酶原的能力，這表明P116蛋白C端是血纖維蛋白溶酶原結(jié)合位點(diǎn)，另外P116蛋白片段能夠黏附PK15細(xì)胞和豬呼吸道纖毛，研究表明P116蛋白是Mhp一個(gè)重要的黏附因子和致病相關(guān)的毒力因子[19]。

1.4 P216

P216蛋白也是一種豬肺炎支原體高度表達(dá)的纖毛黏附因子，由Mhp493基因編碼，蛋白序列相對(duì)保守，在J株、232株、7448株和168株的同源性達(dá)97%，P216蛋白是P97蛋白的一個(gè)同源類似物，能夠裂解成位于菌體表面的P120蛋白(N端，120 kDa)和P85蛋白(C端，85 kDa)，具有結(jié)合肝磷脂和黏附PK15細(xì)胞的能力[20]。杜海霞等[21]原核表達(dá)P216重組蛋白能與Mhp陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，間接免疫熒光試驗(yàn)表明該重組蛋白對(duì)Mhp黏附豬肺上皮細(xì)胞(SJPL)產(chǎn)生占位抑制作用。

1.5 P146

P146蛋白由Mhp684基因編碼，包含1317個(gè)氨基酸，其中N端的400個(gè)氨基酸殘基序列與P97黏附因子相同，其他基序特異。P146蛋白在多重位點(diǎn)被不同加工效率的內(nèi)切蛋白水解成至少9個(gè)菌體表面蛋白片段，產(chǎn)生多樣性的組合，通過(guò)表達(dá)其中3個(gè)片段(P50、P40和P85)重組蛋白發(fā)現(xiàn)均能與免疫Suvaxyn豬支原體肺炎疫苗和感染Hillcrest豬肺炎支原體強(qiáng)毒株6周后的血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)[22]。

1.6 P159

P159黏附因子由Mhp494基因編碼，是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)不屬于P97/P102橫向同源物家族的黏附因子，在233F↓Q234 和981F↓Q982位點(diǎn)裂解產(chǎn)生27 kDa(P27)、110 kDa(P110)和52 kDa(P52)三段不同大小蛋白[23]。劉茂軍等[24]原核表達(dá)P159基因片段(3＇端)重組蛋白能夠與Mhp陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性；表達(dá)的截短蛋白與Mhp的黏附試驗(yàn)結(jié)果表明，該重組蛋白可以黏附于豬肺上皮細(xì)胞(SJPL)表面，并能部分抑制Mhp對(duì)SJPL的黏附作用。

1.7 Mhp107

Seymour L M等[25]報(bào)道Mhp107蛋白是P97蛋白的橫向同源物，是豬肺炎支原體多功能黏附因子家族的一員，對(duì)致病機(jī)理的研究具有重要意義，為了了解Mhp 107蛋白的功能，分別根據(jù)N端、中間結(jié)構(gòu)域和C端設(shè)計(jì)F1Mhp107、F2Mhp107和F3Mhp107重組蛋白，研究表明F1Mhp107重組蛋白能夠結(jié)合豬肝磷脂和血纖維蛋白溶酶原，F(xiàn)3Mhp107重組蛋白能夠結(jié)合纖連蛋白和吸附PK15細(xì)胞，三段蛋白均能吸附豬呼吸道纖毛。

1.8 Mhp271

Mhp271蛋白是P97蛋白旁系同源物，是另外唯一一個(gè)也包含R1和R2重復(fù)序列的黏附蛋白，Mhp271蛋白重復(fù)序列包含一組3個(gè)重復(fù)五肽(R1A271)，2個(gè)重復(fù)十肽(R2271)和另一組6個(gè)重復(fù)五肽(R1B271)，為了研究它們的功能，Deutscher等[26]分別構(gòu)建R1A271重組蛋白(F1271)和R22713R1B271重組蛋白(F2271)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2271重組蛋白能夠結(jié)合肝磷脂、纖連蛋白、豬呼吸道纖毛，而F1271卻不能，這表明Mhp271蛋白R(shí)1和R2必須同時(shí)存在才具有黏附功能。

1.9 Mhp384/Mhp385

Deutscher等[27]發(fā)現(xiàn)P102旁系同源蛋白Mhp384在S/T-X-F↓X-D/E位點(diǎn)被有效的裂解成P60384和P50384兩段，P97旁系同源蛋白Mhp385由115 kDa、88 kDa和27 kDa大小的3段蛋白片段組成，Mhp384和Mhp385 蛋白的各片段均位于胞外，除了P27蛋白片段均能結(jié)合肝磷脂和纖毛。

目前研究發(fā)現(xiàn)的Mhp黏附因子中，除P159蛋白外都屬于P97/P102雙基因操縱子家族。其中P97是目前研究較多黏附因子，在Mhp致病機(jī)理研究、診斷試劑盒的研制和亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)具有很重要的意義。其他黏附因子在蛋白結(jié)構(gòu)和黏附活性上研究較多，對(duì)揭示Mhp的致病機(jī)理提供參考依據(jù)，但抗原性研究有待進(jìn)一步驗(yàn)證，從而篩選出更多可供選擇的抗原性蛋白。

2 膜蛋白

豬肺炎支原體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，缺乏細(xì)胞壁，僅有3種細(xì)胞器：細(xì)胞膜、核糖體和原核細(xì)胞核[9]。菌體的膜蛋白是產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要免疫原之一，膜蛋白一般包括糖蛋白、脂蛋白和熱休克蛋白。其中脂蛋白一般具有較強(qiáng)的抗原性，通常作為Mhp診斷檢測(cè)的目標(biāo)。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)是生物細(xì)胞在受到熱、生物應(yīng)激、理化因素等應(yīng)激原刺激發(fā)生熱休克反應(yīng)后所產(chǎn)生的一類最保守并由熱休克基因所編碼的伴侶細(xì)胞蛋白[28]。目前豬肺炎支原體只有其中一小部分膜蛋白被仔細(xì)研究。

2.1 P46

P46基因的開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1 257 bp，編碼419個(gè)氨基酸，并含有3個(gè)由TGA編碼的色氨酸密碼子，而且均位于親水區(qū)。P46基因種屬內(nèi)相對(duì)保守，可作為豬肺炎支原體分子生物學(xué)檢測(cè)的目的基因。李瑩瑩等[29]所獲得的4株Mhp毒株的P46基因序列與所參考的Mhp J株、232株、7448株及168株的核苷酸同源性為98.4%～99.4%，氨基酸同源性為98.6%～99.5%。陳玉燕等[30]建立的四種豬呼吸道疾病綜合征病原多重PCR檢測(cè)方法和保雨等[31]建立的豬六種重要病原寡核苷酸芯片檢測(cè)方法中，Mhp的引物和探針均根據(jù)P46基因設(shè)計(jì)。

P46蛋白作為Mhp的表面抗原，具有種特異性，是引起早期免疫反應(yīng)的表面脂蛋白，也是Mhp的主要免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，且與其他支原體無(wú)交叉反應(yīng)，可作為血清學(xué)的檢測(cè)的候選蛋白。中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所以P46為包被抗原研制出了豬肺炎支原體重組抗原ELISA檢測(cè)試劑盒。杜改梅等[32]以P46重組蛋白為抗原進(jìn)行血清抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，免疫后30 d可檢測(cè)到較高的抗體水平。沈青春等[33]克隆豬肺炎支原體P46膜蛋白親水區(qū)基因，通過(guò)原核表達(dá)獲得重組蛋白能與豬肺炎支原體高免血清反應(yīng)，具有很好的反應(yīng)原性和特異性，并使用純化的重組蛋白作為間接ELISA包被抗原用于檢測(cè)豬血清中豬肺炎支原體抗體，與現(xiàn)有ELISA檢測(cè)方法相比具有較高的符合率。

2.2 P65

P65是Mhp膜表面脂蛋白，免疫原結(jié)構(gòu)域位于C端且在細(xì)胞膜外側(cè)，N端與脂肪分解酶相似，具有酯酶活性并能分解脂肪酸[34]。P65蛋白主要通過(guò)破壞宿主肺泡細(xì)胞的表面張力來(lái)降低宿主細(xì)胞的穩(wěn)定性，導(dǎo)致肺臟功能性障礙[35]。P65蛋白是豬肺炎支原體的主要免疫優(yōu)勢(shì)蛋白之一，與其他支原體無(wú)交叉反應(yīng)，在豬支原體肺炎發(fā)病過(guò)程中能夠被特異性識(shí)別，常應(yīng)用于Mhp血清學(xué)檢測(cè)和亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)。

劉思遠(yuǎn)等[36]為研究豬肺炎支原體168弱毒株重組蛋白P65的免疫原性，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-P65，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、純化獲得的重組蛋白與佐劑乳化后免疫注射小鼠，通過(guò)ELISA測(cè)定小鼠血清的抗體效價(jià)為1∶12 800；選取抗體效價(jià)較高的小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，保護(hù)率可達(dá)80%，表明重組蛋白P65具有良好的免疫原性。劉茂軍等[37]通過(guò)基因合成獲得P65基因中含有3個(gè)稀有密碼子的前922 bp，利用PCR從豬肺炎支原體l68株擴(kuò)增獲得P65基因后段，然后通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR)將前后段連接后，構(gòu)建重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的重組融合蛋白能夠與Mhp血清呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)并具有良好的免疫原性。另外，應(yīng)用該重組蛋白免疫小鼠，用Mhp全菌蛋白和P65蛋白篩選，制備了1株特異、穩(wěn)定單克隆抗體3G12，該株單克隆抗體可與P65蛋白和Mhp全菌蛋白反應(yīng)，采用間接ELISA法測(cè)得3G12細(xì)胞培養(yǎng)上清與P65蛋白反應(yīng)抗體的效價(jià)為1∶12 800，與全菌蛋白反應(yīng)抗體的效價(jià)為1∶3 200；3G12腹水與P65蛋白反應(yīng)的抗體效價(jià)為1∶4 000 000以上，與168 全菌蛋白反應(yīng)的抗體效價(jià)為1∶20 000以上[38]。之后，使用原核表達(dá)的P65蛋白及制備的P65蛋白單克隆抗體建立阻斷ELISA檢測(cè)方法，該方法的特異性和敏感性與IDEXX商品化的ELISA診斷試劑盒相似，是一種可使用的豬肺炎支原體血清學(xué)檢測(cè)方法[39]。

2.3 Mhp366蛋白

Meens等[40]通過(guò)分析豬肺炎支原體232株基因組編碼的35種預(yù)測(cè)脂蛋白，篩選出105個(gè)可能的B細(xì)胞線性表位，免疫印跡發(fā)現(xiàn)Mhp366蛋白的一個(gè)表位能夠與康復(fù)豬血清有強(qiáng)烈的特異性免疫活性反應(yīng)，卻不能夠與接種疫苗的豬血清發(fā)生反應(yīng)。遂以表達(dá)、純化的GST-Mhp366融合蛋白作為包被抗原，建立ELISA檢測(cè)方法，以80份豬血清為檢測(cè)樣本，同時(shí)與2種商品試劑盒：間接ELISA試劑盒(IDEXX HerdChek Mycoplasma hyopneumoniae1)和阻斷ELISA試劑盒(Oxoid Mycoplasma hyopneumoniae ELISA)的檢測(cè)結(jié)果作對(duì)照，并結(jié)合Western-blot試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白不能檢測(cè)到疫苗免疫豬血清中的Mhp抗體而能檢測(cè)到康復(fù)豬血清中的抗體，Mhp366蛋白是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)能區(qū)分疫苗和野毒感染抗體的蛋白，研究意義重大。

2.4 DnaK蛋白

DnaK蛋白又稱為HSP70，是一種重要的熱休克蛋白，具有免疫優(yōu)勢(shì)抗原的特性，可誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的發(fā)生，其N端的主要作用在于分子伴侶作用，而C端主要表現(xiàn)為免疫原和免疫佐劑的作用。李媛等[41]通過(guò)基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，DnaK基因在Mhp種內(nèi)高度保守，種間差異較大，通過(guò)原核表達(dá)DnaK C端重組蛋白可以與豬肺炎支原體陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的免疫活性。劉茂軍等[42]應(yīng)用DnaK重組蛋白包被板對(duì)所測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果與IDEXX檢測(cè)結(jié)果相比，有很大的非特異性顯色，但是免疫后30 d到45 d抗體產(chǎn)生趨勢(shì)是一致的。

3 胞內(nèi)蛋白P36

P36蛋白又稱乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase，LDH)，是Mhp的一種特異性免疫優(yōu)勢(shì)蛋白。P36基因在Mhp進(jìn)化過(guò)程中高度保守，具有細(xì)菌LDH的典型區(qū)域，并且同源性很高。近幾年，國(guó)內(nèi)對(duì)豬支原體P36基因的研究主要集中在豬支原體檢測(cè)方法的建立和蛋白的表達(dá)方面。因豬肺炎支原體P36基因保守且特異性高，以P36基因?yàn)槟康幕蚪⒌臋z測(cè)方法很多，例如PCR[43]、巢式PCR[44]、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[45]、斑點(diǎn)雜交[46]、顯色原位雜交[47]等檢測(cè)方法。

豬肺炎支原體P36蛋白具有L-乳酸脫氫酶(LDH)活性，具有種屬特異性的抗原決定簇，可作為血清學(xué)檢測(cè)的候選抗原。胡茂志等[48]通過(guò)原核表達(dá)P36蛋白，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，獲得了針對(duì)Mhp P36蛋白的單克隆抗體，為Mhp種特異性檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。祝永琴等真核表達(dá)獲得分泌性P36蛋白，而且具有良好的反應(yīng)原性[49]，并使用酵母表達(dá)的P36蛋白作為包被抗原包被酶標(biāo)板，用羊抗豬IgG-HRP作為酶標(biāo)二抗，建立了穩(wěn)定的抗豬肺炎支原體IgG間接ELISA檢測(cè)方法[50]。

4 展 望

豬肺炎支原體是一種慢性接觸性傳染病，本身致死率不高，但繼發(fā)性感染死亡嚴(yán)重，每年對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。初步統(tǒng)計(jì)，該病在我國(guó)陽(yáng)性感染率約70%～90%，發(fā)病率達(dá)40%以上[51]。飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生條件是影響本病發(fā)病率和死亡率的重要因素，缺乏維生素及礦物質(zhì)或品質(zhì)不良，驟然更換飼料或飼料單純，豬舍潮濕和擁擠、通風(fēng)采光差、豬群缺乏運(yùn)動(dòng)等也影響較大。Mhp主要定植于豬氣管及支氣管中，損壞氣管、支氣管的纖毛上皮細(xì)胞和呼吸道黏膜層，還可以抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，破壞巨噬細(xì)胞的功能，極易發(fā)生繼發(fā)感染和混合感染。

預(yù)防豬支原體肺炎除加強(qiáng)飼養(yǎng)管理外，疫苗免疫也是必不可少的措施，目前商品化疫苗產(chǎn)品主要為進(jìn)口滅活疫苗和國(guó)產(chǎn)弱毒疫苗。國(guó)外滅活疫苗價(jià)格昂貴，使豬場(chǎng)生產(chǎn)成本增加，而且滅活疫苗以體液免疫為主，保護(hù)作用有限。中國(guó)獸藥監(jiān)察所最初研制的Mhp乳兔化弱毒RM48株長(zhǎng)期在乳兔體內(nèi)傳代，無(wú)法適應(yīng)工廠化條件下規(guī)?；呙缟a(chǎn)，之后開(kāi)展培養(yǎng)基疫苗的研究，通過(guò)使用不同的培養(yǎng)基反復(fù)多次誘導(dǎo)傳代，使該菌株逐漸適應(yīng)了培養(yǎng)基生長(zhǎng)，該疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫，免疫效果確實(shí)；另外，該疫苗既可以胸腔注射免疫也可以噴霧或滴鼻免疫，使用方便。江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所研制育成的168株無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)弱毒苗，攻毒保護(hù)率達(dá)80%左右。以上兩株弱毒疫苗打破了國(guó)內(nèi)對(duì)進(jìn)口滅活疫苗的限制，已成為大面積推廣使用、具有較高免疫保護(hù)率的豬支原體活疫苗。

近年來(lái)，隨著對(duì)Mhp分子生物學(xué)研究的發(fā)展，越來(lái)越多的功能蛋白被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，使Mhp致病機(jī)理的研究、血清學(xué)診斷和亞單位疫苗的開(kāi)放等方面有了很大的進(jìn)步。Mhp黏附因子具有結(jié)合豬呼吸道纖毛、肝磷脂、纖連蛋白和血纖維蛋白溶酶原等功能，在豬肺炎支原體致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但目前研究還局限在蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面，其免疫特性還有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。菌體的膜蛋白是產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要抗原之一，通常作為Mhp分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)的目標(biāo)。在新型疫苗研發(fā)方面，專家學(xué)者們一直在對(duì)比和尋找抗原性強(qiáng)、保護(hù)率高的蛋白。雖然豬肺炎支原體新型疫苗的研究很多，但是單一的基因或蛋白組分疫苗的保護(hù)率還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，這還需要專家學(xué)者們進(jìn)一步尋找更加有效的抗原蛋白并考慮多價(jià)苗的免疫效果。

蛋白是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，不同的蛋白在Mhp致病過(guò)程中發(fā)揮不同的作用，所以研究與應(yīng)用的側(cè)重點(diǎn)也不同。本研究綜述Mhp主要黏附因子、膜蛋白及細(xì)胞質(zhì)蛋白等主要保護(hù)性抗原蛋白的研究進(jìn)展，旨為該病原致病機(jī)理研究、特異性診斷方法的建立和新型疫苗的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)MPS的正確診斷、預(yù)防和控制具有重要意義。

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