基于代謝組學(xué)的中醫(yī)證候本質(zhì)研究述要*

代永佳 ，王恒和

1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

中醫(yī)學(xué)是中國(guó)古代人民在古代樸素的唯物論和自發(fā)的辯證法思想指導(dǎo)下，通過(guò)長(zhǎng)期醫(yī)療實(shí)踐逐步形成并發(fā)展成的醫(yī)學(xué)理論體系，以辨證論治為主要診療依據(jù)。隨著新興學(xué)科代謝組學(xué)的出現(xiàn)，給中醫(yī)藥理論體系的研究、中藥現(xiàn)代化提供了強(qiáng)有力的新研究手段。它作為后基因組時(shí)代新的研究方法，最適合于中醫(yī)中藥多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的整體研究［1］。中醫(yī)證候的代謝物組的共性分析和生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，可促進(jìn)“證”本質(zhì)的研究、中醫(yī)辨證的科學(xué)化和定量化。將代謝組學(xué)理念及技術(shù)用于中醫(yī)證型的研究必將帶來(lái)中醫(yī)證型本質(zhì)方面研究的新突破。

1 代謝組學(xué)與中醫(yī)證候

中醫(yī)證候客觀化研究是中醫(yī)藥得到廣泛認(rèn)同和走向世界的必由之路。然而，現(xiàn)有的證候診斷標(biāo)準(zhǔn)和辨證指標(biāo)體系主觀性強(qiáng)，可重復(fù)性差。因此，將證候進(jìn)行定量化、客觀化對(duì)指導(dǎo)中醫(yī)臨床治療尤為重要。近年來(lái)，系統(tǒng)生物學(xué)得到了顯著發(fā)展，代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要分支已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，亦有研究嘗試采用代謝組學(xué)方法研中醫(yī)證候取得了可喜的進(jìn)展［2］。

2 證候代謝組學(xué)臨床研究

2.1 痰阻心脈證 王廣基等［3］利用GC-TOF/MS對(duì)冠心病代謝組學(xué)研究，分析發(fā)現(xiàn)痰阻心脈患者血漿軟脂酸、脯氨酸、門冬氨酸、油酸、谷氨酸、苯丙氨酸和尿酸顯著高于健康對(duì)照組；而次黃嘌呤和4-羥基苯甲酸顯著低于健康對(duì)照組。氣陰兩虛患者血漿琥珀酸、門冬氨酸、3-羥基丁酸、油酸、軟脂酸、硬脂酸、脯氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸顯著高于健康對(duì)照組；而天(門)冬酰胺、色氨酸、次黃嘌呤和4-羥基苯甲酸顯著低于健康對(duì)照組。提示兩證型間多個(gè)內(nèi)源性代謝物的含量存在明顯差異并與能量代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝異常相關(guān)。

2.2 脾氣虛證 張麗等［4］通過(guò)用 UPLC-Q-TOF/MS對(duì)脾氣虛患者尿液進(jìn)行分離檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了一些脾氣虛潛在的標(biāo)記物，有助于脾氣虛證臨床西醫(yī)微觀的診斷，對(duì)中醫(yī)脾氣虛證的量化起了一定的規(guī)范作用。

2.3 熱證 劉樹民等［5］通過(guò)皮下注射2，4-二硝基苯酚建立熱證模型，通過(guò)UPLC-Q-TOF／MS分析其尿液，不僅證明造模成功，還追蹤了代謝產(chǎn)物整體的變化軌跡。

2.4 肝火亢盛、陰虛陽(yáng)亢證 陳藝等［6］按照中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)收集肝火亢盛證和陰虛陽(yáng)亢證的原發(fā)性高血壓患者，運(yùn)用氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜GCTOFMS技術(shù)對(duì)患者血清進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)了顯著差異的代謝產(chǎn)物，并推測(cè)可能與三羧酸循環(huán)、糖、脂肪等代謝途徑有關(guān)。朱嘉等［7］分別納入陰虛陽(yáng)亢證高血壓患者和健康志愿者，通過(guò)色譜技術(shù)及主成分分析方法等尋找和發(fā)現(xiàn)2組間代謝產(chǎn)物的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)纈氨酸、蘇氨酸等游離脂肪酸增加，肌酐及尿素等反應(yīng)機(jī)體代謝增強(qiáng)的物質(zhì)增多等，說(shuō)明運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)能將兩者區(qū)分，確實(shí)存在標(biāo)志性代謝產(chǎn)物。

2.5 痰阻心脈證、氣陰兩虛證、氣滯血瘀證 朱明丹等［8］運(yùn)用超高液相色譜-串線四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)探尋冠心病患者痰阻心脈證、氣陰兩虛證、氣滯血瘀證3個(gè)證型和與健康人的代謝物差異。結(jié)果顯示，冠心病組與正常組比較，脂肪酸代謝，磷酸代謝，氨基酸代謝紊亂及血小板凝聚明顯。

2.6 腎虛證(腎陰虛、腎陽(yáng)虛) 董飛俠等［9］利用GC-MS對(duì)慢性腎病愈期患者尿液進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。結(jié)果表明PCA和OPLS-DA分析能夠很好區(qū)分腎陽(yáng)虛和非腎陽(yáng)虎患者，差異代謝物的關(guān)鍵成分是丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯、脯氨酸、檸檬酸、馬尿酸和組胺等，這些成分與能量代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，組氨酸代謝途徑相關(guān)。

2.7 濕熱蘊(yùn)脾證 趙曉山等［10］應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)慢性胃炎濕熱蘊(yùn)脾證患者唾液進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析結(jié)果表明，2組在流速、唾液代謝產(chǎn)物種類及分布，以及產(chǎn)物含量上有明顯的差異，說(shuō)明慢性胃炎濕熱蘊(yùn)脾證同唾液代謝產(chǎn)物有一定的相關(guān)性。

3 證候代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

3.1 肝氣橫逆證 張惠云等［11］利用UPLC TOF/MS對(duì)大鼠經(jīng)前期綜合征肝氣逆證模型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。分析表征14個(gè)潛在生物標(biāo)記物，包括甲基鳥嘌呤、2，3-二羥基-3-甲基戊酸、D-半乳糖胺、5-氨基戊酸、2-氨基己二酸、D-脯氨酸、褪黑激素、3羥基丙酮酸-5-羧基、4-羥基谷氨酸、2，3- 二氫甲基砒啶酸、去氧腺苷、5，7，4’- 三羥基異黃酮、癸二酸、前列腺素F2α。其中2-氨基己二酸、褪黑激素、4-羥基谷氨酸參與了與情緒活動(dòng)密切相關(guān)的代謝途徑；5，7，4’-三羥基異黃酮與調(diào)節(jié)經(jīng)前期癥狀關(guān)系密切；前列腺素F2α與影響月經(jīng)周期有關(guān)。

3.2 腎陽(yáng)虛證 姜春燕等［12］利用UPLC TOF/MS對(duì)大鼠腎陽(yáng)虛證模型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。觀察大鼠行為狀態(tài)變化，并以血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(COR)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)為客觀指標(biāo)，且通過(guò)灌胃白附片溶液反證3個(gè)方面共識(shí)確定為腎陽(yáng)虛證模型。OPLS分析血漿內(nèi)源性代謝物發(fā)現(xiàn)了3個(gè)腎陽(yáng)虛證的生物標(biāo)記物，分別為溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和468.4 m/z的未知化合物，推測(cè) LPE、LPC的改變可能與造模引起的肝損傷有關(guān)。

3.3 腎陰虛證 Ping Wang等［13］利用UPLC HDMS對(duì)大鼠腎陰虛證模型進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。檢測(cè)尿液代謝輪廓，主成分分析(PCA)發(fā)現(xiàn)腎陰虛證組與空白組有顯著性差異，并結(jié)合正交偏最小二乘判別分析方法(OPLS-DA)找到20個(gè)離子作為腎陰虛證的潛在生物標(biāo)記物，這些物質(zhì)與色氨酸、賴氨酸、嘌呤、嘧啶、三羧酸循環(huán)等代謝通路有關(guān)。給予六味地黃丸后使上述潛在標(biāo)記物的代謝輪廓回調(diào)至正常動(dòng)物水平。

3.4 肝氣郁結(jié)證 王偉明［14］用夾尾法造模建立大鼠肝氣郁結(jié)證模型，藥物組用柴胡疏肝散，通過(guò)比較分析，得出尿液與血液小分子代謝物組的差異性變化譜；同時(shí)還用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)臨床肝氣郁結(jié)證患者與健康人的尿液與血液進(jìn)行觀察及分析，從整體角度來(lái)探尋肝氣郁結(jié)證的生物學(xué)基礎(chǔ)和生理病理機(jī)制。

3.5 心氣虛證 李琪琳等［15］通過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎建立了心梗后心氣虛證心力衰竭大鼠模型，利用核磁共振氫譜技術(shù)檢測(cè)模型組與假手術(shù)組尿液代謝物的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組的代謝物質(zhì)能明顯區(qū)分，與假手術(shù)組相比，其能量代謝、糖代謝、脂代謝等相關(guān)的物質(zhì)含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.6 心血瘀阻證 簡(jiǎn)維雄等［16］通過(guò)結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制作急性心肌梗死(AMI)心血瘀阻證模型，并將其隨機(jī)分為模型組及養(yǎng)心通脈治療組，同時(shí)設(shè)立手術(shù)組及空白對(duì)照組。運(yùn)用GCMS技術(shù)檢測(cè)選取大鼠的心肌組織代謝產(chǎn)物含量的變化。發(fā)現(xiàn)模型組中能加快能量代謝、清除氧自由基作用的甘氨酸、谷氨酸、酪氨酸等代謝產(chǎn)物下降，藥物治療組中此類物質(zhì)明顯升高。這說(shuō)明心梗心血瘀阻證代謝途徑與缺氧后能量代謝紊亂相關(guān)，養(yǎng)心通脈方可以明顯干預(yù)這一過(guò)程。王勇等［17］通過(guò)左冠狀動(dòng)脈前降支放置Ameriod環(huán)制備冠心病心肌缺血血瘀證小型豬模型，并設(shè)立假手術(shù)組，留取血清樣本。采用核磁共振NMR和模式識(shí)別技術(shù)，發(fā)現(xiàn)模型組與假手術(shù)組相比，與糖代謝紊亂相關(guān)的肌酸、乳酸等物質(zhì)含量升高，與脂肪代謝加速相關(guān)的肉堿含量上升及相應(yīng)的VLDL、LDL含量的降低，糖類及脂代謝的紊亂導(dǎo)致檸檬酸循環(huán)中檸檬酸等物質(zhì)含量的升高。王勇等［18-20］研究小豬冠心病心肌缺血血瘀證模型與假手術(shù)組比較，結(jié)果顯示脂代謝、糖代謝紊亂及能量代謝失衡，并存在丙氨酸-丙酮酸-葡糖糖循環(huán)障礙，其中脂代謝紊亂最終導(dǎo)致心肌缺血血瘀證加重，認(rèn)為上述的代謝組合可能成為臨床診療時(shí)的參考指標(biāo)。

3.7 外寒內(nèi)飲證 蓋江華［21］將雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、外寒內(nèi)飲(小青龍湯)模型組和小青龍湯治療組，運(yùn)用核磁共振技術(shù)對(duì)3組大鼠的尿液、血液和肺組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了小青龍湯證的特異性代謝產(chǎn)物，并得出與之相關(guān)的代謝途徑及通道主要為能量代謝、炎癥反應(yīng)和免疫功能這3個(gè)方面。

3.8 大腸濕熱證 劉萍等［22］應(yīng)用炎癥性腸病(大腸濕熱)大鼠模型，通過(guò) NMP，LC-MS/MC，代謝組學(xué)技術(shù)，觀察到大腸濕熱模型尿液中醋酸、肌酸、半胱氨酸、乳酸、?；撬?、二甲胺、乙酸、甲胺、三甲胺水平以及氨基酸含量，與正常動(dòng)物相比存在明顯差異。

4 問(wèn)題與展望

首先，代謝組學(xué)是一門新興學(xué)科，在中醫(yī)證型方面的研究還處于初級(jí)階段，仍有進(jìn)步與完善的空間，況且現(xiàn)有的技術(shù)手段是否能全面準(zhǔn)確地檢測(cè)并篩選出有意義的標(biāo)記代謝物仍是未知數(shù)。再者研究中動(dòng)物模型的建立無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，人和動(dòng)物模型畢竟存在著本質(zhì)的區(qū)別。不過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)運(yùn)而生讓中醫(yī)界人士看到了曙光，加之將實(shí)驗(yàn)和臨床密切結(jié)合，相信用代謝組學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)證型的重要方法之一。

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