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    影響牛體外胚胎生產(chǎn)效率的因素

    2018-02-13 09:02:10王小武趙明禮郝少強郭春明
    今日畜牧獸醫(yī) 2018年11期
    關(guān)鍵詞:卵丘卵母細胞培養(yǎng)液

    王 娜 ,李 姣 ,王小武 ,郭 晶 ,趙明禮 ,郝少強 ,郭春明 ,馬 毅

    (1.天津中科博雅生物育種研究有限公司 300457;2.全國畜牧總站 100125;3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所 300384)

    在牛繁殖領(lǐng)域,大量進行體外胚胎生產(chǎn)已有近30年的歷史,但這主要作為研究手段,一方面用來了解體內(nèi)胚胎正常發(fā)育的過程,另一方面作為其他生物技術(shù)(如轉(zhuǎn)基因、克隆等)的研究材料[1]。然而近年來,牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)越來越得到眾多科研人員的重視,也取得了顯著性的研究成果。國外一些發(fā)達國家已成功將該技術(shù)應(yīng)用于牛生產(chǎn)實踐,而我國仍停留在實驗室研究階段,盡管有將體外受精胚胎進行移植并順利妊娠產(chǎn)下犢牛的報道,但仍處于初期探索階段[2]。因此,為加快我國牛良種繁育進程和擺脫人們?nèi)找鎸M口牛類畜產(chǎn)品的依賴,現(xiàn)階段亟需將該技術(shù)與胚胎移植、活體采卵(OPU)技術(shù)相結(jié)合,應(yīng)用于生產(chǎn)實踐,推廣應(yīng)用。

    與體內(nèi)胚胎相比,體外胚胎移植后的妊娠率顯著低于體內(nèi)胚胎移植后的結(jié)果,其根源在于體外胚胎移植后建立和維持妊娠的能力,這也是限制體外胚胎用于生產(chǎn)實踐的關(guān)鍵因素[3-4]。牛體外胚胎生產(chǎn)主要由卵母細胞體外成熟(IVM)、體外受精、胚胎體外培養(yǎng)等三個關(guān)鍵步驟組成,這三個步驟的順利進行與胚胎移植后的存活及成功妊娠密切相關(guān)。因此,本文總結(jié)了上述三個環(huán)節(jié)中影響胚胎產(chǎn)量和質(zhì)量的因素,以期為后續(xù)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)化研究和推廣應(yīng)用提供參考。

    1 卵母細胞體外成熟

    1.1 卵母細胞來源

    胚胎的大部分遺傳物質(zhì)來源于卵母細胞,因此,卵母細胞的發(fā)育潛力直接影響體外受精和囊胚形成效率,所以,在一定程度上胚胎的發(fā)育潛力在受精時就已經(jīng)被決定了[3]。卵母細胞發(fā)育潛力也稱卵母細胞質(zhì)量,研究表明,卵母細胞來源對卵母細胞質(zhì)量有顯著影響,不同來源的卵母細胞,其質(zhì)量差別也較大[1]。未成熟卵母細胞的來源主要有兩種途徑,一是從屠宰場卵巢中獲取,利用切割或抽吸法獲取卵巢表面2~8mm卵泡內(nèi)的卵丘—卵母細胞復合體(COCs)進行體外成熟[5]。該方法取材容易、成本低,但很難確定卵母細胞的系譜,常用于體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)體系的優(yōu)化研究。二是OPU,即借助B超引導、真空泵抽吸的方式,通過陰道穹隆進行卵巢穿刺采卵。該方法需要一定的操作技巧,對技術(shù)人員的要求較高。操作過程中若真空泵壓力過大,會導致卵丘細胞丟失,裸卵率較高;壓力過小則不易抽出卵母細胞,影響回收效率。因此,需要不斷調(diào)整真空泵的壓力,以獲取數(shù)量多且質(zhì)量好的COCs。而目前的研究結(jié)果顯示,屠宰場卵巢獲得的COCs體外成熟效果要優(yōu)于OPU來源的COCs[6]。這一結(jié)果可能與獲取卵母細胞時的卵泡大小和卵丘細胞特征有關(guān),因為卵泡大小和卵丘細胞特征是影響卵母細胞質(zhì)量的重要因素[4]。但現(xiàn)階段在不損傷卵母細胞的情況下,通過卵泡大小和卵丘細胞特征來評估COCs后續(xù)發(fā)育能力的標準尚未建立,仍需更多更深入的研究。

    1.2 體外成熟條件

    卵泡內(nèi)的微環(huán)境和母體之間通過信號傳遞來支持卵母細胞生長并使其逐漸獲得發(fā)育能力,兩者之間的雙向通信極其復雜,需要多個信號通路的協(xié)同作用,這種高度的復雜性使得辨別卵母細胞后續(xù)的受精和發(fā)育能力異常困難[7]。但研究證實卵母細胞一旦從卵泡中脫除,其發(fā)育潛力就會受到限制,發(fā)育的最大潛力也就被固定了[1]。因此,研究人員通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)液(TCM199)中添加激素、血清、生長因子、抗氧化劑等物質(zhì),結(jié)合培養(yǎng)箱特定的環(huán)境條件,盡量模擬體內(nèi)成熟環(huán)境,以達到最佳的體外成熟效果。

    1.2.1 激素

    促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)是IVM體系中最常見的激素添加劑。補充FSH和LH可以誘導卵丘細胞擴散、細胞核和細胞質(zhì)成熟[8]。除此,類固醇激素LH在哺乳動物卵母細胞成熟過程中對減數(shù)分裂的恢復有重要作用[9]。盡管有研究表明牛COCs的卵丘細胞能夠在培養(yǎng)體系中分泌雌二醇(E2)和孕酮(P4)[10],但是牛COCs的IVM體系通常采用微滴培養(yǎng),即在礦物油覆蓋的培養(yǎng)介質(zhì)中進行成熟,由于油的高吸收能力,介質(zhì)中E2和P4的濃度會降低,從而影響COCs的成熟效果[11]。因此,IVM液中也常添加E2以促進COCs體外成熟,但添加P4的研究較少。

    1.2.2 氣體環(huán)境

    O2對于卵母細胞順利成熟非常重要,但O2水平較高會不利于卵母細胞成熟如活性氧(ROS)的產(chǎn)生,會損傷卵母細胞[12]。生理條件下卵泡液中的O2濃度在3%~13%之間,而大多數(shù)牛的IVM方案中使用20%的O2濃度,這相當于空氣中的O2濃度。因此,卵母細胞體外培養(yǎng)的氣體環(huán)境與體內(nèi)條件差別很大。但也有研究報道,牛IVM期間用5%O2濃度不利于卵母細胞的成熟[13]。因此,現(xiàn)階段關(guān)于牛卵母細胞IVM過程中氣體環(huán)境影響的研究,尚未就卵母細胞成熟的最佳O2濃度得出一致的結(jié)論,需進一步研究探索。

    1.2.3 抗氧化劑

    ROS是配子和胚胎代謝過程中產(chǎn)生的生理副產(chǎn)物,是一種強大的氧化劑,低濃度的ROS在體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理作用,如促進卵母細胞的發(fā)育和調(diào)節(jié)植入前胚胎發(fā)育的速率等,然而,ROS濃度過高可誘導細胞內(nèi)成分的氧化損傷和細胞凋亡,進而對細胞功能產(chǎn)生有害影響[14]。

    由于ROS存在會對卵母細胞成熟產(chǎn)生不利影響,許多研究通過向培養(yǎng)液中添加抗氧化物質(zhì)來消除ROS的影響,如褪黑素[15-16]、番茄紅素[17]、半胱氨酸[18]、白藜蘆醇[19]等,能夠有效地降低牛卵母細胞中ROS含量,提高成熟效果。但也有報道稱這些物質(zhì)在提高胚胎發(fā)育能力方面差異不顯著[19],而具體何種抗氧化物質(zhì)在提高胚胎生產(chǎn)效率方面有突出的效果還未見報道。

    1.2.4 血清、生長因子、糖類物質(zhì)等

    研究表明,在體外成熟液中添加10%的胎牛血清(FBS),有助于卵母細胞成熟及防止透明帶硬化[20]。目前FBS已成為IVM體系中的常規(guī)添加物之一,但進口FBS管控嚴格、價格昂貴,且FBS中未經(jīng)鑒定的激素可能會影響培養(yǎng)基批次的一致性,因此,研究人員轉(zhuǎn)向探索無血清的替代培養(yǎng)液,用牛血清純化得到的白蛋白(BSA)作為替代,現(xiàn)已有商業(yè)化的無血清成熟培養(yǎng)基(如日本FHK公司的IVMD101,英國IVF Bioscience公司的BOIVM)被開發(fā)出來。

    向IVM培養(yǎng)液中添加表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等能促進牛卵母細胞成熟、卵丘細胞擴展[21]。

    IVM期間充足的葡萄糖供應(yīng)是卵母細胞代謝的基本要求。在培養(yǎng)基中添加葡萄糖可促進牛卵母細胞減數(shù)分裂的恢復,但IVM期間高濃度的葡萄糖又不利于隨后的胚胎發(fā)育,研究發(fā)現(xiàn)這是由于細胞內(nèi)ROS升高引起的[22]。當IVM期間使用較低的O2濃度培養(yǎng),同時使用補充葡萄糖的成熟培養(yǎng)基會提高最終的囊胚率[23]。因此,葡萄糖可能與O2代謝密切相關(guān),適量的葡萄糖補充與合適的O2濃度協(xié)同作用才能有助于胚胎發(fā)育。

    2 體外受精

    2.1 精子來源

    通常成熟后的卵母細胞要與處理好的精子在體外條件下共孵育若干小時,才能完成體外受精過程,形成的合子中有一半的核物質(zhì)來源于精子。報道稱精子為胚胎發(fā)育貢獻了用于第一次卵裂的中心粒和一些mRNA[24],精子功能失調(diào)引起的受精延遲可能是導致卵母細胞老化和胚胎發(fā)育缺陷的重要因素[3]。許多研究也表明不同的種公牛,其精子的體外受精能力存在顯著差異[25-26],可見精子來源也是限制體外胚胎生產(chǎn)效率的重要因素,因此,在以后的生產(chǎn)實踐中就需要挑選優(yōu)秀的種公牛精液進行體外胚胎的生產(chǎn)。

    2.2 體外受精液

    目前研究中常用的受精體系有兩種,BO液和TALP液,國外也已有商業(yè)化的試劑(如美國MOFA公司的IVF培養(yǎng)基,英國IVF Bioscience公司的BO-IVF培養(yǎng)基)正在推廣使用。牛凍精經(jīng)37℃水浴解凍后,需先用洗滌液處理,目前通用的處理方法是兩次離心法,但不同的受精體系,精液處理時所用離心力有所不同,離心力過高會損傷精子,過低會影響精子的分離效果。BO液和TALP液需要1500r/min,每次5min[27];而商業(yè)化試劑的受精體系需要328g或400g,離心時間也不盡相同。因為離心機的轉(zhuǎn)速與離心力之間的換算關(guān)系與所用離心機的半徑有關(guān),所以無法就研究中使用的轉(zhuǎn)速與商品試劑中的離心力相比較,因此,以后的研究中也建議明確精子處理的離心力,以便于后續(xù)類似的研究優(yōu)化改進。

    在體內(nèi)條件下,精子獲能是精子在受精前必須經(jīng)歷的一個重要階段,只有經(jīng)過獲能的精子才具有受精能力,因而,在體外也同樣需要此步驟[28]。牛精子體外獲能的方法主要是化學藥物誘導,向受精液中加入肝素或鈣離子載體,其中肝素對精子有害影響小,較為常用[29]。BO液處理精子時還加入了咖啡因,使得精子獲能更快,增強了其獲能效果[6,27]。

    不同的受精體系,受精時間不同,BO液一般為6~8h,TALP液一般為18~24h[30]。但無論何種受精體系,最終受精時調(diào)整后的精子濃度基本都為100萬~200萬個/mL。

    在體外受精環(huán)節(jié)研究中,成熟后的卵母細胞一般要去除部分卵丘細胞,再與精子在受精液中共孵育[31],而商品化培養(yǎng)液則一般要求保留卵丘細胞,盡量不要擾動擴散的卵丘細胞團塊。因此,在去除部分卵丘細胞以及對后續(xù)胚胎發(fā)育影響等方面值得去深入研究,得出更準確的結(jié)論。

    3 體外胚胎培養(yǎng)

    3.1 胚胎培養(yǎng)液

    目前常用的牛體外胚胎培養(yǎng)液主要有CR1aa和SOF液兩種,這類培養(yǎng)體系要求培養(yǎng)過程中需不斷補充添加血清的新鮮培養(yǎng)液,直至第7d發(fā)育至囊胚階段。而商品化的培養(yǎng)液(如美國MOFA公司的IVC培養(yǎng)基,英國IVF Bioscience公司的BO-IVC培養(yǎng)基)則7d內(nèi)無需補充新鮮培養(yǎng)液,大大方便了后期培養(yǎng)。但也有研究表明自配液與商品液的體外胚胎生產(chǎn)效率無顯著差別,但自配液成本要遠低于商品液,因此更傾向于自配體系的推廣使用[32]。

    3.2 共培養(yǎng)

    在哺乳動物中,胚胎早期發(fā)育是影響成功妊娠的最關(guān)鍵步驟之一,這主要發(fā)生在母體輸卵管內(nèi),母體輸卵管為配子受精前的準備、運輸、存活、受精和早期胚胎發(fā)育提供了最佳環(huán)境,胚胎—母體之間的有效聯(lián)系對早期胚胎的成功發(fā)育和存活是必需的[33]。因此,為了更好的模擬體內(nèi)環(huán)境,研究者嘗試在牛體外胚胎培養(yǎng)液中加入一些細胞,使之與早期胚胎共培養(yǎng),目前已經(jīng)在自源、異源卵丘細胞[34]、非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)和輸卵管上皮細胞[35]、馬骨髓間充質(zhì)干細胞和馬羊膜上皮干細胞[36]等方面進行了研究,結(jié)果可不同程度地提高體外胚胎發(fā)育效率和質(zhì)量。但在操作過程中需要嚴格控制加入共培養(yǎng)細胞的濃度,濃度過高,會過多消耗培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分,產(chǎn)生較多的有害代謝產(chǎn)物,對胚胎發(fā)育產(chǎn)生不利影響。

    3.3 培養(yǎng)環(huán)境

    有研究表明胚胎在培養(yǎng)過程中暴露的環(huán)境可能會影響它們的質(zhì)量和活力[37]。同牛的IVM方案中一樣,牛體外胚胎培養(yǎng)體系也都使用20%的O2濃度,而高O2濃度培養(yǎng)會導致ROS的產(chǎn)生增加,損傷細胞的線粒體功能,導致胚胎死亡,因而,培養(yǎng)過程中使用的O2濃度是牛體外胚胎產(chǎn)量的重要決定因素[3]。為此,許多研究者在胚胎培養(yǎng)液中添加抗氧化劑,以阻止ROS對胚胎的損傷,結(jié)果可顯著提高胚胎的質(zhì)量和產(chǎn)量[38]。但也有研究指出在胚胎培養(yǎng)過程中可以使用低氧培養(yǎng)系統(tǒng),當O2濃度從20%降至5%時,可觀察到胚胎發(fā)育率明顯增加[37]。而最近的研究表明低氧培養(yǎng)系統(tǒng)適用于無共培養(yǎng)細胞存在的情況下,共培養(yǎng)條件下仍需用20%的高O2培養(yǎng)系統(tǒng)[35,39]。因此,體外胚胎培養(yǎng)需要根據(jù)使用共培養(yǎng)細胞與否選擇不同的培養(yǎng)條件。

    4 展望

    綜上所述,影響牛體外胚胎生產(chǎn)效率的因素有很多,不能過于看重某一方面的因素,需要從體外培養(yǎng)液的成分和培養(yǎng)環(huán)境的整體效應(yīng)來分析。我國的牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù),雖然實驗研究上已接近發(fā)達國家的水平,不同實驗室都建立有各自的牛體外胚胎生產(chǎn)體系,但在生產(chǎn)實踐上卻不及一些發(fā)達國家。因此,以后的研究在注重提高體外胚胎生產(chǎn)效率的同時,更應(yīng)注重提高體外胚胎移植后的發(fā)育潛力。研究人員可以和胚胎移植實踐者之間建立合作關(guān)系,進行胚胎移植試驗,以獲得更有意義的結(jié)論;或可以利用分子生物學和組學知識來確定體內(nèi)、外胚胎在生物學特征方面的差異,以預測體外胚胎移植后存活的可能性。相信在不久的將來,研究者會很快開發(fā)出更優(yōu)化的牛體外胚胎生產(chǎn)體系,應(yīng)用于生產(chǎn)實踐,加快我國牛良種擴繁的進程。

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