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    揚(yáng)州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平與異煙肼耐藥基因突變位點(diǎn)分布特征分析*

    2018-02-13 09:00:08曾方林束玉鳳王金富揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科江蘇225000
    現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2018年9期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核耐藥性結(jié)核病

    曾方林,束玉鳳,王金富(揚(yáng)州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇225000)

    結(jié)核病為目前世界傳染病中病死率最高的一種傳染病。據(jù)WHO報(bào)告,全球1/3人群(約20億)感染了結(jié)核分枝桿菌,每年新發(fā)結(jié)核病例約900萬,且每年新增病例的5%為多重耐藥性結(jié)核菌株感染[1]。這些耐藥株比敏感株具有更高的病死率和發(fā)病率[2?3]。對(duì)全國(guó)范圍而言,利福平(RFP)與異煙肼(INH)雙重耐藥導(dǎo)致的耐多藥結(jié)核也成為難治性結(jié)核的主要因素。目前,絕對(duì)濃度法和比例法是檢測(cè)結(jié)核藥物敏感性的常規(guī)方法,但其具有耗時(shí)長(zhǎng)(通常需要4~8周)、不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn),易延誤患者的治療,而基于羅氏固體培養(yǎng)法的結(jié)核耐藥診斷是最常用的檢測(cè)方法,但其周期長(zhǎng)、操作煩瑣,也易耽誤患者的治療。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和分子探針雜交技術(shù)的藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法得到廣泛應(yīng)用,可用于快速篩查多重耐藥結(jié)核病患者。如能廣泛、快速地進(jìn)行抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測(cè),對(duì)臨床早期合理用藥具有重要價(jià)值[4]。因此,本研究采用DNA?微陣列芯片法調(diào)查了揚(yáng)州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌(MTB)對(duì)RFP與INH耐藥基因突變位點(diǎn)的分布特征,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 標(biāo)本來源 選取2015年8月至2017年8月本院收治的結(jié)核患者痰涂片抗酸染色陽性且經(jīng)PCR?熒光探針鑒定為MTB患者的標(biāo)本、傳統(tǒng)結(jié)核培養(yǎng)鑒定為MTB的分離株標(biāo)本、PCR?熒光探針法檢測(cè)鑒定為MTB且CT值小于30(Hu)的各類標(biāo)本。

    1.1.2 試劑 分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒和MTB耐藥基因檢測(cè)試劑盒(博奧生物有限公司產(chǎn)品)。檢測(cè)指標(biāo)包括RFP及INH的3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB基因啟動(dòng)子的野生型及不同突變型,其中RFP耐藥相關(guān)基因rpoB基因檢測(cè)6個(gè)位點(diǎn),共13種突變型,含531位TCG→TTG、531位 TCG→TGG、526位 CAC→GAC、526位 CAC→TAC、526位 CAC→CTC、526位 CAC→CGC、511位 CTG→CCG、513位 CAA→CCA、513位 CAA→AAA、516位 GAC→GTC、516位 GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG。INH耐藥相關(guān)基因katG基因、inhA基因各檢測(cè)1個(gè)位點(diǎn),分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個(gè)突變型,inhA基因?15位C→T突變型。改良羅氏培養(yǎng)基為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

    1.1.3 儀器 晶芯LuxScan10K?B微陣列芯片掃描儀、晶芯SlideWasher芯片洗干儀、晶芯BioMixer芯片雜交儀、晶芯Extractor36核酸快速提取儀均為北京博奧生物有限公司生產(chǎn);Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)安捷倫Stratagene公司生產(chǎn)。

    1.2 方法 嚴(yán)格按試劑說明書提取各標(biāo)本核酸,然后進(jìn)行分枝桿菌核酸檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)CT值小于30(Hu)(共進(jìn)行40次循環(huán)擴(kuò)增)的核酸標(biāo)本再按基因芯片法操作說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌甩干和掃描判讀。以芯片自帶的陰陽性對(duì)照作為質(zhì)控,陽性對(duì)照點(diǎn)rpoB IC、katG IC、inhA IC應(yīng)為陽性,陰性對(duì)照點(diǎn)為陰性則判斷實(shí)驗(yàn)有效,否則判定該次實(shí)驗(yàn)無效。

    2 結(jié) 果

    2.1 基本情況 去除重復(fù)檢測(cè)者共檢測(cè)369例,其中MTB陰性23例,MTB陽性346例。346例MTB陽性患者中耐RFP 48例(13.9%),耐INH 78例(22.5%),對(duì)二者同時(shí)耐藥33例(9.5%)。

    2.2 RFP耐藥基因分布 48例RFP耐藥標(biāo)本中RFPrpoB基因耐藥位點(diǎn)分布為531(TCG→TTG)位點(diǎn)24例(50.0%),526(CAC→TAC)位點(diǎn) 12 例(25.0%),526(CAC→CGC)位點(diǎn) 5例(10.4%),526(CAC→GAC)位點(diǎn) 1例(2.1%),511(CTG→CCG)位點(diǎn) 4例(8.3%),516(GAC→GTC)位點(diǎn)1例(2.1%),516(GAC→TAC)位點(diǎn)1例(2.1%)。

    2.3 INH耐藥基因分布 78例INH耐藥標(biāo)本中INH katG基因耐藥位點(diǎn)分布為315(AGC→ACC)位點(diǎn)54例(69.2%),315(AGC→AAC)位點(diǎn)5例(6.4%);inhA基因耐藥位點(diǎn)分布為?15(C→T)位點(diǎn) 18例(23.1%),其中katG基因315位AGC→ACC聯(lián)合inhA基因?15位C→T突變1例(1.3%)。

    3 討 論

    RFP與INH作為最重要的一線抗結(jié)核藥物組合,檢測(cè)MTB對(duì)RFP與INH的敏感性對(duì)治療用藥具有重要價(jià)值。本研究使用MTB耐藥基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行MTB對(duì)RFP與INH的耐藥性檢測(cè),并在前期研究驗(yàn)證過該方法具有良好的適用性[5]。該方法與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)比較,具有檢測(cè)速度快、高通量、靈敏度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),能很好地替代傳統(tǒng)藥敏檢測(cè)。針對(duì)目前揚(yáng)州地區(qū)尚未規(guī)模化進(jìn)行RFP與INH耐藥基因分布情況研究的現(xiàn)況,通過本研究以期了解揚(yáng)州地區(qū)RFP與INH主要耐藥基因的分布特征,推動(dòng)揚(yáng)州地區(qū)對(duì)耐藥結(jié)核病的早期診斷水平,提高治療水平。

    RFP主要作用于MTB DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位,干擾轉(zhuǎn)錄的開始及RNA延伸,發(fā)揮抑菌和殺菌作用[6]。95.0%對(duì)RFP耐藥菌株的突變發(fā)生在rpoB基因81 bp的熱點(diǎn)區(qū)域(編碼密碼子為507~533位)[7]。該區(qū)域被稱為RFP耐藥決定區(qū)(RRDR),85.0%耐藥菌株出現(xiàn)531位Ser、526位His和516位Asp基因變異。本研究采用MTB耐藥試劑盒檢測(cè)rpoB基因RRDR的531、526、516、511、533 位密碼子,結(jié)果顯示,揚(yáng)州地區(qū)531、526突變位點(diǎn)為優(yōu)勢(shì)突變位點(diǎn),其中531位點(diǎn)占50.0%(24/48),526位點(diǎn)占 37.5%(18/48),最常見突變位點(diǎn)為531(TCG→TTG)突變位點(diǎn)(50.0%)和526(CAC→TAC)突變位點(diǎn)(25.0%),與相關(guān)研究結(jié)果相似[8?11]。

    INH主要作用于細(xì)胞壁中的分枝菌酸、DNA、脂類等成分[12]。在耐 INH的 MTB分離株中有 50%~70%katG基因發(fā)生突變[13]。inhA基因編碼的烯?;€原酶是INH作用的靶點(diǎn),與耐藥性密切相關(guān),inhA基因突變導(dǎo)致INH耐藥的菌株達(dá)總耐藥株的25.0%[14]。本研究采用MTB耐藥試劑盒檢測(cè)katG基因的315位密碼子和inhA基因的?15位密碼子,結(jié)果顯示,揚(yáng)州地區(qū)katG基因突變占主導(dǎo)地位[75.6%(59/78)],inhA基因突變占次要地位(23.1%),其中 katG基因 315位 AGC→ACC聯(lián)合inhA基因?15位C→T突變1例(1.3%)。katG基因315(AGC→ACC)為主要突變位點(diǎn)(69.2%),inhA 基因?15(C→T)突變位點(diǎn)占 23.1%,與相關(guān)研究結(jié)果相似[8?11]。

    另外,據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,最近在RFP耐藥菌株中的rpoB?RRDR發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的突變基因——Asp516Thr和Ser531Gly基因,以及在rpoB外也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)突變基因——Ile572Phe基因[15]。此外,INH耐藥相關(guān)基因——katG和inhA基因雖然為主要突變基因,但有研究表明,由于katG和InhA操縱子的改變而導(dǎo)致MTB耐INH的分離株只占80.0%,還有20.0%耐INH分離株的這2個(gè)基因均無變化,可能還有其他耐藥機(jī)制的存在[16]。然而,MTB耐藥檢測(cè)試劑無法包含上述所有突變基因和突變形式,在檢測(cè)結(jié)果中有可能出現(xiàn)對(duì)RFP與INH實(shí)際上耐藥而檢測(cè)結(jié)果敏感的情況,因此,該方法檢測(cè)的RFP與INH的敏感性只能作為參考,并不能確診。但參考作者的前期研究,基因芯片法仍具有良好的靈敏度和特異性[5],加之其速度快、高通量、靈敏度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),也可作為當(dāng)前該地區(qū)臨床MTB耐藥篩選的重要手段。

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