慢性萎縮性胃炎動物模型研究進展

楊 洋，劉志新，瞿先侯，尹 璐,劉亞欣,楊 敏，劉 濤，魏 瑋

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院,北京 100102;2. 功能性胃腸病中醫(yī)診治北京市重點實驗室，北京 100102；3. 北京四環(huán)制藥有限公司，北京 100025；4. 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)是消化系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病。慢性萎縮性胃炎伴腸化生(intestinal metaplasia，IM)或異型增生(Dysplasia，Dys)被認為是胃癌的癌前病變(PLGC),與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān), 萎縮性胃炎和腸化發(fā)展為胃癌的概率為0.8%和1.8%，異型增生則為0.6%～8%[1]。因此,阻斷和逆轉(zhuǎn)PLGC,降低胃癌的發(fā)生一直是研究的熱點。由于CAG病因復(fù)雜，西醫(yī)學(xué)對CAG尚缺乏理想的治療措施,而中醫(yī)藥辨證治療療效甚佳，不但能緩解癥狀，在延緩病理進展甚至逆轉(zhuǎn)病變方面有一定優(yōu)勢[2]。 隨著對 CAG 認識的不斷深入和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，中醫(yī)藥治療 CAG 的機制研究也得到了深入和發(fā)展。CAG動物模型是深入研究發(fā)生機制和評價相關(guān)藥物效果的必不可少的工具。筆者瀏覽近年相關(guān)文獻，將現(xiàn)有較為成熟的CAG模型分類敘述，并梳理目前常用的模型評價手段，為中醫(yī)藥實驗科研提供參考。

1 西醫(yī)病理模型

1.1化學(xué)造模法 由于不健康飲食習(xí)慣、不當(dāng)用藥等引起化學(xué)因素對胃黏膜的反復(fù)損傷，是CAG的重要病因之一，流行病調(diào)查顯示，我國華東地區(qū)人群胃癌癌前病變相關(guān)的危險因素包括阿司匹林等非甾體抗炎藥的使用、經(jīng)常食用辛辣及腌制食品、H.pylori感染、飲酒、焦慮等[3]。實驗中常利用化學(xué)試劑模仿高危因素對大鼠進行干預(yù)，選用的化學(xué)因素有N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(N-Methyl-N-nitroso-N’-nitroguanidine，MNNG)、氨水、去氧膽酸鈉、抑酸劑、非甾體抗炎藥、乙醇等。MNNG是一種亞硝胺制劑，它不依賴酶的代謝作用，能直接作用于胃黏膜上皮，可誘發(fā)DNA鏈上的堿基發(fā)生突變，具有致癌作用[4]，實驗證實，MNNG飲水或灌胃可誘導(dǎo)出大鼠胃癌及胃癌前模型[5]；氨水模擬H.pylori感染狀態(tài)下高氨對胃黏膜的毒性損害；去氧膽酸鈉模擬膽汁反流損傷胃黏膜作用；非甾體抗炎藥可使胃黏膜局部產(chǎn)生氧自由基, 引起血管內(nèi)皮細胞損傷, 進而發(fā)生胃黏膜損害，同時能夠抑制前列腺素的合成, 而前列腺素具有胃黏膜保護作用[6]；乙醇對胃黏膜具有刺激作用，能影響胃黏膜的屏障與組織變化，Bienia等[7]研究證實持續(xù)酗酒易致胃黏膜萎縮性炎癥，萎縮的發(fā)生與嗜酒時間長短有關(guān)；高熱鹽水會造成大鼠胃上皮細胞增生和壁細胞的丟失,誘發(fā)胃小凹細胞増生和腺體萎縮[8-9]。以上因素造成反復(fù)的慢性損傷及炎癥刺激致使胃固有腺體被破壞而發(fā)生萎縮。

張瀝等[9]將7周齡健康SD大鼠隨機化分為6組,正常喂養(yǎng)組(正常喂養(yǎng),飲白開水)、正常對照組(25 ℃白開水灌胃, 每日1次,每次2.5 mL)、鹽水組(25 ℃150 g/L氯化鈉灌胃,每日1次,每次2.5 mL)、熱水組(5 ℃蒸餾水灌胃, 每日1次,每次2.5 mL)、熱鹽水Ⅰ組 (55 ℃ 150 g/L氯化鈉灌胃,每日1次,每次2.5 mL)、熱鹽水Ⅱ組 (55 ℃ 150 g/L氯化鈉灌胃,每日2次,每次2.5 mL)。結(jié)果熱鹽水灌胃至10周, 大鼠胃黏膜出現(xiàn)萎縮，熱鹽水Ⅰ組及熱鹽水Ⅱ組之間大鼠胃黏膜改變無統(tǒng)計學(xué)差異。鹽水、熱水灌胃至10周, 2組大鼠胃黏膜均未見萎縮改變, 但延長灌胃至第24周時胃黏膜出現(xiàn)萎縮改變。林海燕等[10]采用2%水楊酸鈉溶液2 mL灌胃，每日1次，連續(xù)6周，后3周結(jié)合饑飽刺激、游泳運動疲勞模型，6周可見模型組大鼠胃黏膜層變薄,不完整，腺體有不同程度的萎縮，固有層內(nèi)可見毛細血管擴張瘀血，大量淋巴細胞浸潤，間質(zhì)內(nèi)結(jié)締組織增生，細胞大小形態(tài)不一。

長期抑酸導(dǎo)致高胃泌素血癥, 可能誘發(fā)CAG[11]。魏玥等[12]采用雷尼替丁與MNNG聯(lián)合造模,制成化0.03%雷尼替丁的特殊飼料供大鼠自由食用,期間不予其他食物，成功復(fù)制CAG模型。何偉等[13]對小鼠采用奧美拉唑低劑量組(6 mg/kg) 、高劑量組(30 mg/kg)及MNNG聯(lián)合奧美拉唑灌胃24周，實驗結(jié)果提示奧美拉唑組小鼠腺胃萎縮性胃炎、腺體不典型增生發(fā)生率均明顯增加。奧美拉唑組小鼠胃癌發(fā)病率增加，其中MNNG+奧美拉唑低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，MNNG+奧美拉唑高劑量組小鼠前胃癌明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2手術(shù)造模法 常用的有胃空腸吻合術(shù)及彈簧幽門植入術(shù)。Roblescampos等[14]通過對進行胃部手術(shù)患者的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，萎縮性胃炎及腸化與膽汁反流密切相關(guān)。胃空腸吻合術(shù)是將大鼠的胃竇大彎與空腸進行吻合；彈簧幽門植入術(shù)采用將金屬彈簧置入幽門環(huán)而導(dǎo)致幽門環(huán)持久性擴張，兩種手術(shù)均模擬膽汁反流，可成功復(fù)制CAG模型。董西林等[15]將健康成年雄性SD大鼠屈氏韌帶以下4 cm處的空腸側(cè)壁與胃大彎前胃部分的前壁，順蠕動方向進行側(cè)吻合，造模9個月后部分大鼠胃黏膜出現(xiàn)腺體萎縮，腺腔擴大，腺體數(shù)目減少。楊鴻等[16]通過對大鼠施行胃空腸吻合術(shù)合十二指腸橫斷術(shù)，術(shù)后14周出現(xiàn)胃黏膜萎縮，20周出現(xiàn)異型增生及假幽門腺化生。張玉祿等[17]將長約2 cm，直徑0.2～0.3 cm的金屬彈簧的前1/3從胃前壁距幽門環(huán)0.2 cm處插過幽門環(huán)進入十二指腸，用縫線將彈簧兩端及中央固定。手術(shù)1周后開始每周每只大鼠灌胃60～70 ℃高鹽熱淀粉糊2次(含15%氯化鈉)，每次2 mL，連續(xù)24周。24周后大鼠胃黏膜出現(xiàn)多灶性萎縮性，并部分伴有輕至中度不典型增生。以上手術(shù)造模法成模時間短，但常受術(shù)式影響，模擬的膽汁反流量無法確定, 所造成大鼠黏膜損傷的不一致，常同時段淺表與萎縮模型混雜。且手術(shù)后感染的高發(fā)使得動物死亡率較高。

1.3生化、免疫法 慢性萎縮性胃竇炎的發(fā)病與局部免疫活化有關(guān)系[18]。戴關(guān)海等[19]用同種大鼠的胃黏膜，生理鹽水勻漿液，與完全福氏佐劑以1∶1比例配成乳劑，每只大鼠皮下注射0.3 mL，隔30 d再以相同劑量皮下注射1次，聯(lián)合去氧膽酸鈉、乙醇刺激，連續(xù)造模90 d，成功復(fù)制慢性萎縮性胃炎模型。張淑芹等[20]將Wistar大鼠(雌雄各半)皮下注射佐劑抗原(用同品系大鼠胃黏膜的生理鹽水組織勻漿與Freund 佐劑1∶1配成乳劑)0.3 mL，3周后重復(fù)注射1次,單日禁食,雙日飽食。6周后出現(xiàn)胃黏膜皺襞不規(guī)則,表層黏液細胞間質(zhì)擴張、水腫、固有層增生,有嗜酸粒細胞和淋巴細胞浸潤,幽門腺區(qū)有局灶性小腸上皮化生。

幽門螺桿菌(H.pylori)感染為CAG致病因素之一。1997年Lee等[21]從臨床分離出H.pylori菌株SS1,此菌株能長期有效地定植在實驗動物胃中,并成功在實驗動物胃中產(chǎn)生慢性炎癥、黏膜萎縮、腸上皮化生及不典型增生等病理變化。

1.4綜合造模法 單因素模型造模時間長，模型穩(wěn)定性差，多因素聯(lián)合造模法可提高模型成型率，縮短成模時間。且慢性萎縮性胃炎病因復(fù)雜，故實驗中常采用聯(lián)合多種因素的綜合造模法，模擬人類不健康生活習(xí)慣，使胃黏膜損傷和修復(fù)反復(fù)進行，更貼近臨床發(fā)病機制。魏玥等[22]用120 mg/L的MNNG溶液灌胃，5 mL/kg，1次/d，配合自由飲用0.1%氨水溶液及進食含0.03%雷尼替丁的顆粒狀飼料，3種因素聯(lián)合建立CAG伴Dys大鼠模型。28周末造模成功。唐旭東等[23]利用灌胃接種H.pylori菌株SSI及20 g/L水楊酸鈉與體積分?jǐn)?shù)0.6的乙醇混合溶液方法建立H.pylori感染CAG模型，14周后檢測H.pylori定植情況及胃竇黏膜病理。結(jié)果模型組慢性炎癥及固有腺減少程度均明顯高于單純H.pylori感染組、單純水楊酸鈉乙醇灌胃組。

各種因素的恰當(dāng)組合是誘導(dǎo)穩(wěn)定模型，探索CAG發(fā)病及治療機制的前提。但不同因素的選用或藥物劑量的不同均可造成模型的差異。如不同濃度MNNG可誘導(dǎo)出大鼠前胃(無腺體區(qū))鱗癌和后胃腺癌[24]?？紫槿愕萚25]采用MNNG自由飲用聯(lián)合灌胃、雷尼替丁飼料、饑飽失常、燙熱高鹽飲食能成功誘導(dǎo)大鼠胃癌前病變模型；但聯(lián)合大劑量MNNG灌胃使PLGC誘變率降低，死亡率上升，并出現(xiàn)明顯前胃鱗狀上皮病變。在人類胃鱗癌屬特殊類型胃癌，發(fā)病率不足1%。實驗選擇MNNG劑量時應(yīng)考慮所需模型病理類型。謝晶日等[26]將雄性大鼠分為3組，A組予單純MNNG灌胃,B組予MNNG復(fù)合熱鹽水及雷尼替丁飼料飲食，C組予MNNG乙醇溶液灌胃復(fù)合熱鹽水及雷尼替丁飼料飲食造模，3組均加用饑飽刺激。A組19周造模成功，B組14周造模成功，C組12周造模成功，提示復(fù)合加乙醇可以促進MNNG溶解,提高誘發(fā)率,縮短造模時間。但同時馮秀雪等[27]研究發(fā)現(xiàn)30%乙醇灌胃10周后出現(xiàn)肝細胞脂肪變，匯管區(qū)血管、血竇及小葉中央靜脈擴張充血，但未出現(xiàn)壞死及纖維化。故采用乙醇復(fù)合法應(yīng)慎重選擇乙醇濃度及干預(yù)頻率。

1.5其他 含馬兜鈴酸中藥關(guān)木通提取物可以在較短時間內(nèi)形成理想的胃癌前病變模型。李春英等[28]將SD 大鼠隔日給予關(guān)木通乙醇提取物(主要成分馬兜鈴酸)不同劑量灌胃1次。10周時各劑量組可見前胃黏膜乳頭狀瘤增生。馬兜鈴酸5.0 mg/kg、10.0 mg/kg劑量組即可見胃癌前病變。造模15周時，馬兜鈴酸5.0 mg/kg、10.0 mg/kg劑量組及其以上劑量組的胃癌前病變發(fā)生率高達100%。造模20周時，可見多數(shù)動物發(fā)生胃癌。

鈷60(60Co)具有極強的輻射性，金東明等[29]對大鼠采用氨水自由飲用30 d，期間60Co照射1次。造模組胃黏膜壁細胞減少,壁細胞出現(xiàn)大量空泡樣變性,腺體萎縮,黏膜厚度變薄,黏膜層及黏膜下層有大量炎細胞浸潤,胃竇G細胞減少,部分大鼠胃黏膜出現(xiàn)了明顯的腸上皮化生。成功復(fù)制慢性萎縮性胃炎模型。

2 病癥結(jié)合模型

CAG病癥結(jié)合模型實際上是在單純CAG疾病模型的基礎(chǔ)上,復(fù)合中醫(yī)證候模型。陳小野等[30-31]采用主動免疫加脫氧膽酸鈉和阿司匹林水溶液交替飲用法進行疾病造模, 在CAG 造?；A(chǔ)上進行脾虛證、肝郁證和腎虛證復(fù)合造模。脾虛證造模采用耗氣破氣加饑飽失常法, 肝郁證造模采用夾尾加腎上腺素注射法, 腎虛證造模采用甲基硫氧嘧啶(MTU)飲用法。不同證型的模型CAG 大鼠, 胃腺體萎縮、胃黏膜炎癥等病理改變存在差別, 以脾虛、腎虛證為顯著；并發(fā)現(xiàn)模型肝臟出現(xiàn)肝組織纖維化、點狀壞死灶、血漿ALT、AST活性、炎細胞浸潤，程度等以腎虛型胃炎為最重。

陸為民等[32]采用MNNG自由飲用、雷尼替丁灌胃、饑飽失常的綜合法造模20周,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胃黏膜形態(tài)有典型的CAG病理改變,且肝、脾、胸腺質(zhì)量減輕, 血液RBC-IC花環(huán)率、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血栓素B2(TXB2)、6酮前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)含量及TXB2/6-keto-PGF1α比值增高,RBC-C3b 受體花環(huán)率、SOD、GSH-Px活力降低，表明大鼠血管收縮功能及血小板聚集作用紊亂、抗氧化功能及紅細胞免疫功能降低。與臨床CAG癌前病變氣虛血瘀證表現(xiàn)有較好的一致性。

徐珊等[33]復(fù)制大鼠肝郁證、脾虛證、濕熱證的CAG病證結(jié)合模型，在CAG模型復(fù)制的同時, 脾虛CAG組第7周開始采用苦寒瀉下(每日灌胃生大黃煎劑)加饑飽失常法(采取單日禁食,雙日足量喂食，連續(xù)4周。)建立脾虛證候模型。肝郁組第7周開始采用夾尾刺激(30 min/d),同時每7 d腹側(cè)皮下注射腎上腺素0.1 mg 1次,共注射4次,造模4周。濕熱第7周開始撤除普通飼料, 換用高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠;同時每天將大鼠置入造模箱內(nèi)(恒溫干燥箱內(nèi)置超聲霧化器和濕溫度表),調(diào)節(jié)箱內(nèi)溫度(33±2)℃ , 相對濕度(95±3)% ，每天2 h。造模第4周發(fā)現(xiàn)不同證型的CAG大鼠胃黏膜炎癥和萎縮程度存在差異。脾虛組大鼠胃黏膜炎癥和萎縮程度明顯重于肝郁組和濕熱組大鼠, 肝郁組和濕熱組大鼠胃黏膜炎癥和萎縮程度差異無顯著性, 說明CAG大鼠胃黏膜炎癥和萎縮程度與證候有一定的相關(guān)性。

3 模型評價

3.1病理組織學(xué) CAG診斷金標(biāo)準(zhǔn)為病理組織學(xué)診斷，目前無論京都共識[34]還是中國慢性胃炎共識意見( 2012年，上海)[35]，病理診斷仍沿用直觀模擬評級法，動物實驗仍參考臨床，判斷腺體萎縮病理組織學(xué)分級、腸上皮化生及異型增生分度。

3.2胃分泌功能 CAG常伴有胃分泌功能的減低，故通過病理組織學(xué)研究，胃泌素及血清蛋白酶原可一定程度反應(yīng)胃黏膜萎縮的程度[36-37]。故評價模型時常測量胃泌素、胃蛋白酶原，甚至測量胃液pH值來評價模型及干預(yù)效果。謝晶日等[38]采用MNNG自由飲用，0.3 g/kg雷尼替丁喂養(yǎng)，配合饑飽失常等綜合方法進行造模，3個月后觀察到模型組大鼠胃液pH值較正常組明顯升高，同時，病理上黏膜萎縮，黏膜腺體排列紊亂，復(fù)制模型成功。

3.3病癥結(jié)合模型評價 大鼠CAG模型評價指標(biāo)主要為病理變化，同時在造模階段和干預(yù)階段各組大鼠一般情況及宏觀表征情況可為病證結(jié)合模型評價提供參考。在造模階段，模型組大鼠出現(xiàn)偏小，皮毛散亂，黯淡無光，蜷縮少動喜扎堆，反應(yīng)遲鈍，大便不成形，或便粒干結(jié)較小、耳廓唇周及爪甲發(fā)白等，符合中醫(yī)理論的脾胃虛弱表現(xiàn);尾部紫暗，舌質(zhì)瘀紫則為瘀毒阻絡(luò)的表現(xiàn)[39]。也有研究借助生化指標(biāo)評價證候[32]，更多的病癥結(jié)合CAG模型則缺乏中醫(yī)證候的評價[30-31，33]。中醫(yī)證候的動物模的診斷依據(jù)應(yīng)包括在狀(本證)、病因 (正證)、治療(反證)、相關(guān)因素(位證)、客觀指標(biāo)(佐證)5個方面[40]。在CAG中，診斷與評價病證結(jié)合模型仍缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

3.4其他評價 鄒世潔等[41]觀察大鼠慢性萎縮性胃炎證病結(jié)合模型脾虛組、肝郁組和腎虛組的心、肺、肝、脾、腎、胸腺、胃、十二指腸、空腸、氣管、頜下腺等臟器的組織病理。CAG造模采用脫氧膽酸鈉和阿司匹林水溶液交替飲用加免疫損傷法, 脾虛造模采用耗氣破氣加饑飽失常法, 肝郁造模采用鉗夾激怒加腎上腺素注射法, 腎虛造模采用MTU飲用法。結(jié)果與對照組比較:各實驗組臟器組織病理均有明顯的萎縮性改變,嚴(yán)重程度腎虛組>肝郁組和脾虛組；變性(壞死)改變方面以腎虛組最為明顯;炎癥改變以腎虛組較為明顯;細胞免疫功能下降方面, 以脾虛組和腎虛組最為明顯;脾虛組和肝郁組有一定的體液免疫功能下降表現(xiàn)。本實驗重視慢性造模的證病結(jié)合模型其他臟器組織病理的觀察, 提示CAG大鼠其他臟器也存在萎縮改變，具有一定意義。

4 小 結(jié)

CAG是消化系統(tǒng)難治病，目前沒有特效藥，疾病的發(fā)生發(fā)展十分復(fù)雜。CAG的動物模型的建立，是深入探討其本病的發(fā)病機制及療效機制的基礎(chǔ)。中醫(yī)藥治療本病，機制研究不明確。而中醫(yī)CAG病癥結(jié)合動物模型仍存在問題。首先多在塑造西醫(yī)疾病模型后加載中醫(yī)因素干預(yù)，以期復(fù)制中醫(yī)證候。而在臨床實踐中疾病與證候應(yīng)具有密切的關(guān)聯(lián)性,也應(yīng)具有發(fā)展階段的同步性,這種病證結(jié)合造模方法割裂了病與證的聯(lián)系，不符合中醫(yī)臨床實踐，也不符合中醫(yī)理論的要求。其次，人和實驗動物宏觀和微觀的疾病變化規(guī)律也不完全一致，無法將人的證候評價標(biāo)準(zhǔn)復(fù)加到動物身上，還需尋求證候本質(zhì)與疾病病理狀態(tài)關(guān)聯(lián)性大的檢測指標(biāo)評價模型的狀態(tài)。故為了全面、客觀地認識CAG疾病病理生理變化發(fā)展，進行中藥藥理機制研究和中藥藥效的評價, 仍需深入研究動物模型。

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