分離植物甘油酯的薄層層析色譜法的優(yōu)化

陳亞東， 薛金嫚， 徐 婷， 劉 華， 雷 潔， 甘 毅

(1.浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院，浙江臨安 311300；2.浙江農林大學林業(yè)與生物技術學院，浙江臨安 311300；3.南京農業(yè)大學農學院，江蘇南京 210095)

脂類(lipids)是生物細胞膜的主要組成成分，在植物光合作用、細胞信號傳導、逆境脅迫等生命活動中扮演著極其重要的角色[1-5]。從極性上分，脂類可分為極性脂和中性脂，前者包括單半乳糖二酰甘油(mono galactosyl diacyl glycerol，簡稱MGDG)、雙半乳糖二酰甘油(di galactosyl diacyl glycerol，簡稱DGDG)、硫脂-硫代異鼠李糖二酰甘油(sulfo quinovosyl diacyl glycerol，簡稱SQDG)、磷脂酰甘油(phosphatidyl glycerol，簡稱PG)、磷脂酰膽堿(phosphatidyl choline，簡稱PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，簡稱PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidy linositol，簡稱PI)、磷脂酸(phosphatidic acid，簡稱PA)等，后者包括三酰基甘油(triacyl glycerol，簡稱TAG)、二?；视?diacylglycerol，簡稱DAG)等。

長期以來，將各種甘油酯進行有效分離，是深入進行植物脂類代謝研究的前提條件。到目前為止，分離植物甘油酯的方法主要有薄層層析色譜分析(TLC)、柱層析色譜法、高效液相色譜(HPLC)等。TLC是一種快速、準確分離脂質的重要方法，它通過不同極性的脂類在固定相和展開相中的相對移動速率差異將脂質進行分離并顯色，從而進行脂質含量和組分的測定。由于TLC方法具有快速、直觀、操作簡便和廉價的優(yōu)點，所以在脂類代謝領域應用最為廣泛，并且該種方法也廣泛應用于檢測酶的活性[6-8]。但是，TLC分離脂質的效果易受到外界環(huán)境條件的影響，如氣溫、濕度等。目前，常見的TLC分離分為單向和雙向2類。單向分離溶劑系統(tǒng)常采用正己烷 ∶乙醚 ∶乙酸(體積比70 ∶30 ∶1)作為展開相，用于分離植物三?；视?TAG)和極性脂[9]。也有一些研究采用丙酮 ∶甲苯 ∶水(體積比91 ∶30 ∶8)作為展開相，分離植物樣本中的糖脂和磷脂[10]。由于單向TLC不能很好地分離出PC、PE、PI、PS等磷脂組分，所以雙向TLC應運而生。雙向TLC是將點樣后的硅膠板先進行一個方向的層析展開，然后將層析板順時針旋轉90°，進行第2個方向的層析。結束后顯色刮板，刮取不同的脂質組分斑塊，進行后續(xù)的分析。在相關文獻中，雙向TLC常采取三氯甲烷 ∶甲醇 ∶水(體積比65 ∶25 ∶4)進行第一相展開，然后再使用三氯甲烷 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(體積比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5)進行第二相分離展開[11]。上述溶劑系統(tǒng)在脂類研究中非常常見，適用于大多數(shù)植物種子樣本的脂質分離。但是，筆者在使用上述溶劑系統(tǒng)分離擬南芥幼苗、煙草葉片等甘油酯含量很低的樣本時卻發(fā)現(xiàn)，該方法在單向和雙向TLC試驗中，均無法得到良好的脂類分離效果，各種脂質斑塊聚集在一起，不能很好進行區(qū)分。為了解決上述問題，筆者嘗試用新的溶劑系統(tǒng)來優(yōu)化雙向TLC，開發(fā)了以三氯甲烷 ∶甲醇 ∶氨水(體積比 65 ∶35 ∶5)和三氯甲烷 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(體積比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5)作為第一和第二展開相的雙向TLC分離方法。該方法可以有效地分離油脂含量較低的植物樣本中的糖脂和磷脂，為研究植物膜脂代謝提供了一種簡便有效的工具。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7080B型氣相色譜儀，美國，配置FID檢測器；DB-23色譜柱，TLC Silica G 60型硅膠板，1.05721.0001，默克集團，德國；37種脂肪酸甲酯標準品，F(xiàn)AMQ005，AccuStandard，美國；磷脂酰甘油(PG)標準品，841188P，Avanti，美國；磷脂酰乙醇胺(PE)標準品，P8193，Sigma，美國；磷脂酰膽堿(PC)標準品，P7443，Sigma，美國；磷脂酰絲氨酸(PS)標準品，P0474，Sigma，美國；磷脂酸(PA)標準品，830856p，Avanti，美國；磷脂酰肌醇(PI)標準品，P0639，Sigma，美國；心磷脂(cardiolipin，CL)，C0563，Sigma，美國；振蕩儀(VORTEX-GENIE 2)；大型低溫離心機，eppendorf 5810R；冰箱，三洋化學試劑有限公司；氮吹儀，米歐儀器；數(shù)顯恒溫金屬浴，米歐儀器；正己烷，百靈威；甲醇，百靈威；三氯甲烷，西隴科學；丙酮，高晶化工；甲酸，生工生物工程(上海)股份有限公司；28%氨水，國藥集團；濃硫酸，西隴化工股份有限公司；冰乙酸，上海凌峰化學試劑有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，BHT。

1.2 樣本總脂的提取

2017年5月，在浙江農林大學平山溫室，以播種后15 d的擬南芥植株(哥倫比亞生態(tài)型)幼苗和完全成熟的煙草(K326品系)葉片為材料，稱取0.5 g樣品鮮質量，在液氮中磨成粉末，加入6 mL提取液(三氯甲烷 ∶甲醇 ∶甲酸，體積比10 ∶10 ∶1)，振蕩混勻，置于-20 ℃過夜。以3000g轉速離心10 min，吸取上清液，轉移到12 mL玻璃管中。在沉淀中，加入三氯甲烷 ∶甲醇 ∶水(體積比5 ∶5 ∶1)，振蕩混勻，3 000g離心10 min，吸取上清，合并到第1步的上清中。在合并的上清中，加入3 mL H3PO4(0.2 mol/L)和KCl(1 mol/L)混合液，振蕩混勻，3 000g離心10 min，吸取下層三氯甲烷相，氮吹濃縮至500 mL體積。將三氯甲烷轉移到2mL安捷倫進樣瓶中，-20 ℃保存?zhèn)溆?，此樣本為總脂提取物，可以用于分離中性脂和極性脂。

1.3 單向薄層層析分析

1.3.1 中性脂的分離 配制溶劑相正己烷 ∶乙醚 ∶乙酸(體積比70 ∶30 ∶1)，置于層析缸中，使缸中蒸氣壓達到充分飽和。在120 ℃烘烤處理2 h的層析硅膠板上，用鉛筆在距離底邊2 cm處輕劃橫線，每2 cm做1個標記，用于點樣。然后，待硅膠板降至室溫，用毛細玻璃管吸取50 mg樣品進行點樣，同時加入4 μg的橄欖油作為參照，進行層析展開。當展開相液面距離玻璃板上沿1 cm時，結束層析，采用碘蒸汽或者櫻草黃對硅膠板上的脂類斑塊進行染色。

1.3.2 分離糖脂和磷脂 用0.15 mol/L硫酸銨浸泡硅膠板30 s，在空氣中放置2 d之后，120 ℃活化2 h。配制展開相溶劑系統(tǒng)(丙酮 ∶甲苯 ∶水，體積比91 ∶30 ∶8)，在層析缸中充分飽和1 h。在硫酸銨處理的硅膠板上，距離底邊2 cm處，分別添加150、125、100、75、50、25 mg的樣品，各樣品間距2 cm，在另一塊相同的硅膠板上分別加入10 μg的各種磷脂標準品。將加樣后的硅膠板輕輕放置到層析缸中，蓋緊上蓋，進行層析，待溶劑線到達距離硅膠板頂端1 cm處，取出硅膠板，在通風櫥中自然風干，均勻噴施0.5 mg/mL櫻草黃溶液，在紫外燈下觀察各個脂類成分形成的斑塊。

1.4 雙向薄層層析分析

在經過活化的硅膠板上，用鉛筆標記點樣位置，在距離底邊和左側邊2 cm處，用玻璃毛細管分別吸取75 mg樣品，均勻輕柔地點在3塊相同處理的硅膠板上，進行雙向TLC分離。首先將硅膠板垂直插入第一向層析缸中，展開溶劑為三氯甲烷 ∶甲醇 ∶氨水(體積比65 ∶35 ∶5)或者三氯甲烷 ∶甲醇 ∶水(體積比65 ∶25 ∶4)，當溶劑線到達頂部，取出硅膠板，在通風櫥中，將殘留的溶劑充分揮發(fā)。然后將硅膠板順時針旋轉90°，迅速插入第二向層析缸中，第二向溶劑系統(tǒng)為三氯甲烷 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(體積比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5)。當溶劑線到達頂部時，取出硅膠板，在通風櫥中，將殘留的溶劑充分揮發(fā)。最后，在晾干的硅膠板上噴施櫻草黃溶液，在紫外燈下進行觀察、拍照。

1.5 脂類的甲酯化和氣相色譜分析

在硅膠板上，用鉛筆標記分離后的各個脂質組分，用刀片刮下，倒入12 mL玻璃瓶中。加入2 mL甲醇(含有1%硫酸和0.01% BHT)和7.5μg C17：0TAG內標，80 ℃加熱反應2 h，在冰上冷卻1 min，加入2 mL的0.9%NaCl溶液和2 mL正己烷，振蕩萃取，3 000g離心10 min，吸取上層正己烷上清液，轉移到玻璃管中(注意不要吸入下層水相)。將正己烷濃縮至20 μL，置于安捷倫2 mL進樣瓶中，在7890B型氣相色譜(DB23色譜柱、FID檢測器)上進行GC分析，具體分析參數(shù)設置如下：載氣為氦氣，進樣口溫度260 ℃，分流比為20 ∶1，柱溫箱起始溫度為160 ℃，以20 ℃/min的速度升溫至 240 ℃，保持5 min，F(xiàn)ID檢測器的氫空比設置為1 ∶10。

2 結果與分析

2.1 經典溶劑系統(tǒng)對低油組織樣本中的極性脂分離效果

以往的脂類研究常以正己烷 ∶乙醚 ∶乙酸(體積比 70 ∶30 ∶1，溶劑系統(tǒng)A)作為單向TLC的展開相，此溶劑系統(tǒng)具有穩(wěn)定、重復性好等優(yōu)點，不僅廣泛應用于動物以及微生物，而且也應用于植物樣本的中性脂和極性脂分離。本研究使用了該溶劑系統(tǒng)對煙草葉片等油脂含量極低的營養(yǎng)組織樣本進行了層析分離。從圖1可以看出，通過碘蒸汽染色或噴施櫻草黃，紫外線照射成像，使用正己烷 ∶乙醚 ∶乙酸(體積比70 ∶30 ∶1)作為展開相，很好地分離開了樣本中的中性脂和極性脂，從硅膠板上沿到點樣原點，依次為固醇脂(sterol ester)、三?；视?TAG)、二?；视?DAG)等中性脂，而極性脂(MGDG、DGDG、PC、PG、PE、PI、PA、PS等)則聚集在點樣原點周圍，此外，一些含量相對較少的物質，如游離脂肪酸等，也被分離出來。由于煙草葉片中的中性脂(主要是TAG)含量極低，樣本葉齡對分離效果影響很大，生長后期，衰老的葉片樣本(如4～6周齡的成年擬南芥)脂質組分可以被上述方法分開，而幼嫩葉片中中性脂含量極低，上述系統(tǒng)不能很好區(qū)分。

在葉片等植物營養(yǎng)組織中含有大量的半乳糖脂，如MGDG、DGDG等，為了將磷脂、中性甘油酯與糖脂進行分離，又采用了另1種已報道的溶劑系統(tǒng)[10]，即丙酮 ∶甲苯 ∶水(體積比91 ∶30 ∶8，溶劑系統(tǒng)B)，對標準品和樣品進行了單向TLC分離。如圖2所示，該系統(tǒng)對糖脂的分離效果較好，能夠清晰地區(qū)分各種糖脂的條帶，但是由于磷脂PI和PE的極性較為接近，二者分離效果不好。同時，發(fā)現(xiàn)該溶劑系統(tǒng)易受上樣量的影響，當上樣量超過75 mg時，各個組分之間容易產生交叉污染。后續(xù)的氣相色譜分析也表明，該系統(tǒng)對MGDG的分離效果較好，但是對其他甘油酯的分離效果并不理想。

盡管單向TLC具有簡便、省時的優(yōu)點，但其不易分離極性脂，因此，一般研究者會使用雙向TLC對植物樣本進行分離。本研究也按Benning等的方法[11-12]，用雙向TLC[第一向展開溶劑為三氯甲烷 ∶甲醇 ∶水(體積比 65 ∶25 ∶4)，第二向展開溶劑為三氯甲烷 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(體積比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5，溶劑系統(tǒng)C]對組織樣本中的糖脂和磷脂進行分離，從圖3-A可以看出，TLC分離存在著比較嚴重的拖帶現(xiàn)象，因此該溶劑系統(tǒng)在現(xiàn)有條件下無法得到良好的分離效果。

原因可能是市面上常見的G60硅膠板，由于G硅膠呈弱酸性，所以適用于酸性和中性物質的分離，但是堿性物質能與酸性硅膠作用，展開時易出現(xiàn)成點不清晰或者拖尾現(xiàn)象[13-14]。在層析過程中，樣本的堿性物質在溶劑系統(tǒng)中部分解離，帶有負電荷的物質會與酸性硅膠氫離子發(fā)生結合，才造成了拖尾或重疊的現(xiàn)象，筆者發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象在樣本油脂含量較低時會比較明顯。

2.2 優(yōu)化后的溶劑系統(tǒng)可以有效分離低油組織樣本中的糖脂和磷脂

為了解決低油樣本TLC分離中的拖帶現(xiàn)象，筆者對雙向TLC溶劑系統(tǒng)進行了優(yōu)化，采用了第一向三氯甲烷 ∶甲醇 ∶氨水(體積比65 ∶35 ∶5)和第二向三氯甲烷 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(體積比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5)溶劑系統(tǒng)D進行分離。首先，為了確定各個磷脂組分在雙向TLC分離后的相對位置，筆者使用了7個脂類標準品(PC、PE、PI、PS、PG、PA、CL)的混合樣本來測試優(yōu)化后的溶劑系統(tǒng)。從圖3-C可以看出，除了PS、CL，該溶劑系統(tǒng)有效地分離出了PG、PE、PC、PI和PA，各種脂類標準品在硅膠板上都形成了輪廓清晰的斑塊。由于植物葉片中PS和CL含量十分稀少，所以該方法可用于分離植物葉片樣本中的甘油酯。由于一些磷脂組分在層析時會發(fā)生電離，如PG、PI等磷脂呈酸性，而PC、PE帶有—NH3+和—N—，呈堿性，所以在優(yōu)化方案中，筆者在第一向溶劑系統(tǒng)中加入了一定比例的氨水，是為了用銨根離子去中和硅膠板上的氫離子，減少由于電荷吸引而造成的拖尾，使得斑塊清晰[15-17]。用該方法對擬南芥樣本的脂類分離(圖3-B)顯示，各個甘油酯成分輪廓清晰銳利，不存在交叉污染，雖然在PE周圍存在幾種其他的脂類，在分辨時存在干擾，但是因為植物葉片中PE的含量高，該點大且亮，所以仍然可以對PE進行區(qū)分。

在植物中除了甘油磷脂，還存在較多的半乳糖脂，半乳糖脂中不飽和脂肪酸的含量明顯高于磷脂，同時含有特定的脂肪酸組分，如在MGDG中存在較高含量的C16：3，PG中含有反式棕櫚烯酸，DGDG與其他甘油酯脂肪酸組分相比亞麻酸的含量最高，SQDG組分中棕櫚酸所占百分比最高，所以根據(jù)這些特點，也可以對各個糖脂以及磷脂進行區(qū)分。本研究用氣相色譜分析了經過分離后的擬南芥葉片中的各種極性脂類的脂肪酸組成，并與已報道的擬南芥糖脂和磷脂脂肪酸組分進行了對比[12]。從表1可以看出，各個成分的脂肪酸組分基本與其一致，但是在DGDG中C18：3含量低于已報道的文獻，這可能是因為擬南芥所在的環(huán)境條件影響到了膜脂脂肪酸的組成。

3 討論與結論

本研究還發(fā)現(xiàn)一些其他因素也會對脂質分離效果產生較大的影響：(1)環(huán)境溫度。當試驗環(huán)境溫度在25～30 ℃，該系統(tǒng)會達到良好的分離效果。這是因為環(huán)境溫度可能會影響到層析缸內的飽和蒸汽壓狀況，進而影響到脂類分離的效果。(2)層析缸質量。值得說明的是，從少量植物樣本中提取的糖脂以及磷脂含量比較少，如果試驗過程中混入其他脂溶性雜質或脂質，就會引起較大的誤差。目前，市場上的層析缸多

表1 經過優(yōu)化方法分離的樣本的脂類成分氣相色譜分析

采用多塊玻璃粘制而成，不能排除一些黏合劑成分，可能會溶解于有機溶劑中，對硅膠板產生污染。因此，使用一體成型款式的層析缸，可以避免上述可能的污染。(3)硅膠板質量。硅膠顆粒的大小和涂板的均勻程度，會影響到微量樣本的層析分離，本試驗采用默克G-60硅膠板進行微量脂類成分的分離，其硅膠粉末直徑較小，涂板較為均勻，適用于微量樣本的層析分離。(4)上樣量的選擇。在上樣量方面，50～100 mg樣本即可達到較好的分離效果，超過這個范圍會存在不同程度的拖帶現(xiàn)象，而過少則會使GC檢測出的峰值過小，引起較大誤差。而上樣時點樣的形狀也會影響分離效果，本研究使用玻璃毛細管進行點樣，點樣形狀接近圓形，控制其直徑小于5 mm，否則易造成拖帶現(xiàn)象。(5)樣本的抗氧化處理。在糖脂中存在大量不飽和脂肪酸，在進行甲酯化過程中，易被氧化，造成不飽和脂肪酸含量低的表象，所以甲酯化過程須要添加抗氧化劑，如BHT等。

綜上所述，本研究提供了1種用于分離植物脂質的雙向TLC方法，分別采用三氯甲烷 ∶甲醇 ∶氨水(體積比65 ∶35 ∶5)和三氯甲烷 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(體積比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5)作為層析展開相，該方法可以有效分離微量組織樣本中的磷脂和糖脂，為廣大研究植物脂質代謝的研究人員提供一種簡便有效的工具。