活體取樣并鑒定荷花花芽分化時期的方法研究

胡 鑫， 王彥杰， 金奇江， 楊平仿， 徐迎春

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095； 2.中國科學(xué)院植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點實驗室，湖北武漢 430074)

荷花(Nelumbonucifera)為睡蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬(Nelumbo)多年生水生草本植物，是我國十大傳統(tǒng)名花之一，栽培歷史悠久，有著深厚的文化底蘊；其花高雅脫俗，具有很高的觀賞價值，其藕(根狀莖)、蓮子、葉可食用或藥用，具有很大的經(jīng)濟(jì)價值，是我國目前種植面積最大，品種資源最豐富的水生觀賞經(jīng)濟(jì)植物[1]。

荷花開花及花發(fā)育的分子機理是目前的研究熱點，通常需要采集處于分化狀態(tài)的花芽鮮樣作為研究材料，但由于以下幾個原因?qū)е潞苫ɑㄑ旷r樣的采集工作十分困難：(1)荷花花芽的分化時間很短，自花芽開始孕育到分化結(jié)束只有 3～5 d[2]。有學(xué)者觀察到，當(dāng)花柄形成且開始伸長的時候(此時花柄還未出土，更未出水)，花芽分化已經(jīng)進(jìn)入了雄蕊分化期。所以當(dāng)人們?nèi)庋劭吹交ū鏊⒙冻龌ɡ贂r，此時花芽的分化早已完成，已經(jīng)處于花芽的發(fā)育階段，此時取樣已無法開展針對分化階段花芽的相關(guān)研究，大大限制了荷花花發(fā)育的分子機制研究工作的順利開展。(2)由于荷花的花芽發(fā)生于地下的根狀莖上，要想準(zhǔn)確取到處于分化狀態(tài)的花芽必須將根狀莖挖出，操作十分不便。且由于荷花花芽的芽體很小，似米粒大小，靠肉眼剝芽觀察很難判斷出花芽分化處于哪個階段。(3)雖然采用石蠟切片法及電鏡掃描法能夠準(zhǔn)確鑒別花芽分化的時期[3]，但這2種方法耗時較長，且都要殺死并破壞花芽(縱切或橫切)，無法滿足花芽活體取樣的要求，導(dǎo)致對花芽本身的研究無法進(jìn)行[4-6]。

目前的研究中僅有將花芽、頂芽、相連的蓮藕及蓮葉進(jìn)行采樣，其中花芽和頂芽采用石蠟切片法鑒定花芽分化時期，再將對應(yīng)不同花芽分化時期的蓮藕及蓮葉進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測定[7]，對花芽本身并沒有深入的研究。而借助體視顯微鏡進(jìn)行活體剝芽觀察，不僅不會破壞花芽的芽體，可迅速觀察辨別花芽分化的時期，還可進(jìn)行花芽樣品鮮樣的保存。很多植物借助體視顯微鏡觀察可快速鑒別所取的花芽所處的分化時期，對花芽本身進(jìn)行相應(yīng)地研究，如苦瓜花芽分化的解剖學(xué)觀察及花粉活力的研究[8]。而在荷花上尚未見到相關(guān)報道。

因此，本研究以盆栽荷花品種為試驗材料，采集根狀莖上的花芽，并在體視顯微鏡下剝芽觀察其解剖結(jié)構(gòu)特征，鑒別其所處的花芽分化階段，確定花芽分化時的花芽發(fā)育狀態(tài)，為準(zhǔn)確地進(jìn)行處于分化期的花芽的取樣提供技術(shù)手段，為后續(xù)以花芽為試驗材料的相關(guān)研究提供了材料保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以江蘇南京藝蓮苑水生花卉公司提供的重瓣型荷花品種春雨(圖1)為試驗材料。于2015年5月上旬，將供試品種的種藕種植于460 mm×310 mm的塑料花盆中，土層厚約 20 cm，水層3～5 cm，共250盆，每盆1株，正常肥水管理。

試驗材料共250盆，正常開花230盆，所需各個狀態(tài)花芽分別取樣約200個，體視顯微鏡觀察200個。

1.2 花芽取樣方法和解剖學(xué)觀察方法

通過觀察發(fā)現(xiàn)，供試荷花品種在第4張立葉出現(xiàn)之后即可肉眼觀察到出水的花枝(花柄出水，花蕾清晰可見)，因此對花芽的取樣均在第4張立葉開過1朵花之后進(jìn)行。采樣時間在2015年6—8月之間。

選取已開花的盆栽荷花植株上，首先根據(jù)葉片的幼嫩程度確定最新長出的立葉，然后用手從該立葉的葉柄基部深入到泥中向下挖，直到觸碰到立葉所著生的藕節(jié)，將其挖出，一般緊鄰該立葉著生1個花枝，有的已出泥但未出水，有的可能已出水；自花枝向立葉的生長方向即為藕鞭生長的方向；順著該方向，繼續(xù)沿藕鞭向前挖，依次可以看到未出泥的葉芽及花芽、最新生成的頂芽，該花芽以及頂芽內(nèi)的花芽即為仍處于分化狀態(tài)的花芽。

分別采集以下3種不同發(fā)育狀態(tài)的花芽：(1)頂芽中的花芽：主要是種藕的頂芽，包括子藕開花后的頂芽；(2)未出泥的花芽：此時葉芽已沖出芽鱗，花芽緊靠于葉柄背后，具有長柄；(3)剛出泥的花芽：此時立葉已經(jīng)形成，花芽已沖出芽鱗。

芽子采后立即在體視顯微鏡下用解剖刀進(jìn)行剝芽解剖，以觀察判別花芽分化的進(jìn)程。

剝芽的方法：用鑷子將芽的外鱗輕輕剝掉，不要傷及芽體；當(dāng)出現(xiàn)內(nèi)層結(jié)構(gòu)時，在體視顯微鏡下用解剖針小心地去除內(nèi)層小鱗片，使其生長點露出，參照文獻(xiàn)報道的荷花花芽分化各階段的形態(tài)特征進(jìn)行供試材料所處分化階段的鑒別，并拍照[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷花花芽著生的部位及發(fā)生的順序

根據(jù)對荷花植株生長的田間觀察及翻盆觀察，發(fā)現(xiàn)最新的立葉基部旁總伴生花芽，頂芽中也包含花芽。從圖2中可看出，沿著種藕的生長方向，花芽著生于葉芽后面，因此，可以通過葉芽花芽所處位置辨別生長方向，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)尚在泥中的最新立葉及伴生花芽。

2.2 荷花頂芽的基本結(jié)構(gòu)

從圖3可知，1個完整的頂芽，具有第1復(fù)合芽及可觀察的第2復(fù)合芽。將復(fù)合芽進(jìn)行進(jìn)一步的解剖觀察。

從圖4可以看出，花芽的第1復(fù)合芽中花芽已經(jīng)成形，花柄伸長；第2復(fù)合芽中雖然葉片以及花芽雖很小，但是也可以清晰地看到花柄伸長。

筆者猜測，分化初始期、萼片分化期、花瓣分化期均在頂芽的第2復(fù)合芽中完成，整個花芽分化過程均在泥中進(jìn)行，當(dāng)花芽出泥后均已接近分化結(jié)束。因此，在肉眼可以判斷花芽并可采到花芽的情況下，基本沒有觀察到雄蕊分化前的分化情況。

2.3 荷花3種發(fā)育狀態(tài)花芽的形態(tài)特征

觀察發(fā)現(xiàn)，供試品種3種發(fā)育狀態(tài)的花芽的形態(tài)特征如下(圖5)：(1)頂芽中的花芽。此時花芽與葉芽一起仍被芽鱗片包裹在頂芽中，具有花柄，淡黃色，無刺，花萼頂端帶有紅色。(2)未出泥的花芽。此時葉芽已沖出芽鱗，花芽緊靠于葉柄背后，花柄伸長，淡黃色，無刺，芽體變大。(3)剛出泥的花芽。此時立葉已經(jīng)形成，花芽已沖出芽鱗，花柄上帶刺，但未見陽光，仍呈現(xiàn)淡黃色，花萼顏色變深。(4)與此對比的是已經(jīng)分化結(jié)束的已出水的花芽，花芽獨立生長，花柄帶刺，綠色，花萼顏色更深且?guī)в芯G色。

在剝芽法下，根據(jù)采樣的類別不同，利用體視顯微鏡可以分辨出來的是雄蕊分化期、雌蕊分化期、花托向上發(fā)育期：(1)頂芽中的花芽基本處于雄蕊分化階段，可觀察到花瓣原基的細(xì)胞進(jìn)一步分裂并繼續(xù)伸長的同時，其內(nèi)側(cè)基部表皮下細(xì)胞分裂又形成新的突起，成為雄蕊原基(圖6-1、6-2)。(2)未出泥的花芽基本處于雌蕊分化階段，可觀察到雄蕊原基內(nèi)側(cè)、花原基頂部中央表皮下的細(xì)胞發(fā)生分裂，花托的頂部逐漸分化出若干個小丘狀突起，即為心皮原基，隨后轉(zhuǎn)變成為短柱狀突起(圖6-3、6-4)。(3)剛出泥的花芽由于雌蕊原基的細(xì)胞分裂速度不同，可觀察到雌蕊原基形成了外側(cè)高、內(nèi)側(cè)低的淺杯狀，然后轉(zhuǎn)變成為桶狀，頂端逐漸匯合，而后保留1個小孔，當(dāng)心皮生長到一定的高度時，花托內(nèi)所保留的分生組織開始分裂，使得花托體積不斷擴大并向上生長，逐漸包圍于心皮之外，構(gòu)成了海綿狀的花托，心皮各自埋藏于花托組織中(圖6-5、6-6)。至此花芽分化結(jié)束。

2.4 荷花花芽分化初始期的推測

經(jīng)過整個生長季的持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，供試荷花品種的所有復(fù)合芽，都具有能夠分化出葉芽及花芽的能力。根據(jù)田間對荷花開花現(xiàn)象的觀察，可以推測出相關(guān)規(guī)律，對今后的荷花花芽分化具體研究奠定基礎(chǔ)。

從供試的荷花品種的花芽出現(xiàn)的規(guī)律來看，在環(huán)境適宜的情況下，花芽分化初始時期相同，即它在第4張立葉下開始形成花芽，在根狀莖的分枝(子藕)上表現(xiàn)相似，也必須發(fā)育到第4張立葉才會出現(xiàn)花芽。

3 討論與結(jié)論

本研究采取直接挖取花芽，進(jìn)行體視顯微鏡活體解剖觀察，從而鑒定所處花芽分化時期，并通過大量的解剖觀察，將花芽分化時期與荷花花芽發(fā)育狀態(tài)相對應(yīng)，因此不用進(jìn)行解剖和顯微觀察就可以直接確定花芽分化時期并進(jìn)行芽體的鮮樣保存，這與石蠟切片法和掃描電鏡法相比更加簡便、快捷，且可以獲得完整的花芽鮮樣。一般進(jìn)行花芽取樣觀察時，多是進(jìn)行翻盆取藕，這對處于生長旺盛期的植株是破壞性的，并且也需要一定的體力操作；而本試驗對植株生長進(jìn)行觀察便可判斷出種藕生長方向，并確定花芽的位置，直接取樣，不需將整株取出，不會破壞植株其他側(cè)芽的生長，也可進(jìn)行2次采樣。

本研究在取樣的過程中，由于種藕存在差異，營養(yǎng)儲存的程度不同，導(dǎo)致花芽形成時的大小不同，花芽花蕾的長度大小與其所處的分化階段、發(fā)育階段沒有直接的關(guān)系。另外，由于栽種時種藕所處的土層有差異，生長發(fā)育情況不一致，花芽出水或出土?xí)r所處的土層厚度與其所處的生長階段沒有直接的關(guān)系。因此，花芽長度、花蕾大小、出土的土層厚度等指標(biāo)并未進(jìn)行定量測定。

從研究結(jié)果來看，重瓣型荷花品種的解剖結(jié)構(gòu)與前人的研究結(jié)果[4]相同。通過石蠟切片法觀察知道重瓣品種的花芽分化主要有分化起始期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期、花托向上發(fā)育期；采用剝芽法，更加直觀迅速地鑒定荷花花芽分化的過程，并簡化了花芽分化時期的判斷方法，在頂芽中尚未沖出芽鱗片的花芽處于雄蕊分化階段；在已沖出芽鱗且未出泥的葉芽旁的花芽處于雌蕊分化階段；已經(jīng)出泥的花芽處于雌蕊分化后期以及花托向上生長發(fā)育階段。雖然無法判斷出全部6個分化時期，但了解這個過程，仍有助于進(jìn)行花芽分化時的采樣工作，對花芽本身進(jìn)行進(jìn)一步的研究具有重要意義。

以此類推，筆者在其他瓣型品種也用同樣的方法進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)普遍具有這樣的規(guī)律，但也存在個別特殊例子，比如宜良千瓣，在生長初期很少出現(xiàn)花芽，推測宜良千瓣需要大量的營養(yǎng)來供給開花，因而到后期才會大量形成花芽，本研究的取樣方法只能在開花后起效。另也觀測到未形成立葉便已有花芽的品種，先成花不長葉，后長葉少成花，這種特例不符合常規(guī)規(guī)律，因而無法準(zhǔn)確地取得花芽。綜上所述，對于一般荷花盆栽品種，該方法均可適用。