長三角地區(qū)果蔬灰霉病病菌對5種殺菌劑的抗藥性檢測

盧曉雪， 聶國嬡， 孫海燕， 張金鳳， 陳懷谷， 魏利輝

(江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所，江蘇南京 210014)

果蔬灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的真菌病害，目前已經(jīng)成為一種全球范圍的真菌病害。灰葡萄孢寄主范圍廣，可以侵染多種蔬菜、果樹以及其他經(jīng)濟作物，一旦發(fā)病就會給農業(yè)生產(chǎn)造成重大危害[1]?；颐共〉姆乐我恢笔且粋€重要問題，目前生產(chǎn)上主要以化學防治為主，化學防治主要有苯胺基嘧啶類嘧霉胺、苯并咪唑類多菌靈、二甲酰亞胺類腐霉利等[1-2]。灰霉病病菌具有寄主范圍廣、遺傳變異快等特點，且由于連續(xù)長期單一使用化學藥劑，灰霉病病菌已經(jīng)對上述藥劑產(chǎn)生抗藥性，這在國內外多個地區(qū)的多種作物上均有報道[3-4]。已有研究表明，江蘇、浙江以及安徽等地區(qū)草莓、黃瓜、番茄等寄主上的灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利等傳統(tǒng)殺菌劑產(chǎn)生了較高的抗藥性[5-7]。

咯菌腈和啶酰菌胺是生產(chǎn)上登記防治灰霉病病菌效果較好的新型殺菌劑，其中咯菌腈最初于2009年在我國登記使用，用于防治菊花灰霉病[1]，目前關于灰霉病病菌對咯菌腈產(chǎn)生抗藥性的報道較少[8]。啶酰菌胺是屬于新型煙堿類殺菌劑，在21世紀初引入我國，用于防治黃瓜灰霉病，對灰霉病病菌具有較好的防治效果[9-10]。但在國內外不同地區(qū)，已有關于灰霉病病菌對啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性的報道，2010年Avenot等報道了啶酰菌胺的田間抗性菌株[11]，2012年余玲等在山西省發(fā)現(xiàn)了對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的菌株[12]。

由于灰霉病病菌的抗藥性在生產(chǎn)上造成的一系列問題[13-14]，同時為了綜合評價長三角地區(qū)果蔬灰霉病病菌對傳統(tǒng)型殺菌劑和新型殺菌劑的抗藥性現(xiàn)狀，筆者從我國江蘇、浙江、上海等9個地區(qū)，在番茄、草莓、萵苣等6種果蔬產(chǎn)區(qū)采集灰霉病病樣，采用最低濃度抑制法檢測灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、咯菌腈、啶酰菌胺等的抗藥性，以期為不同地區(qū)不同作物灰霉病的田間用藥和化學防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集與純化

2013—2014年，在鹽城、淮安、鎮(zhèn)江、揚州、南通、蘇州、上海、嘉善、寧波等9個地區(qū)的塑料大棚內，采集來自草莓、黃瓜、番茄、萵苣、瓠瓜、西瓜等6種果蔬作物的病葉或病果，病葉或病果放于自封袋中帶回實驗室，在無菌條件下，經(jīng)過分離純化共得到210個灰葡萄孢單孢株系，轉移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，簡稱PDA)培養(yǎng)基斜面上，保存于 4 ℃ 冰箱中備用。菌株的詳細信息如表1所示。

表1 待測灰霉病病菌菌株信息

1.2 供試藥劑

95%嘧霉胺原藥，購自江蘇豐登農藥有限公司；98%多菌靈原藥，購自江蘇省江陰凱江農化有限公司；98%腐霉利原藥，購自江西禾益化工股份有限公司；96%咯菌腈原藥，購自江蘇省無錫路浩化工有限公司；98%啶酰菌胺原藥，購自河北美星化工有限公司。

98%多菌靈原藥用0.1 mol/L HCl溶液溶解成 1 000 μg/mL 母液，其他原藥均用少量丙酮溶解配制成 1 000 μg/mL 母液，均貯存于4 ℃冰箱待用。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g切成小塊，加水煮爛，用紗布過濾，加入15 g瓊脂，10 g葡萄糖，補足 1 000 mL 去離子水。PDA培養(yǎng)基用于灰霉病病菌的分離、菌株保存以及灰霉病病菌對多菌靈、腐霉利、咯菌腈的抗藥性測定。根據(jù)Chapeland等的方法[4]配制培養(yǎng)基用于灰霉病病菌對嘧霉胺的抗藥性測定，培養(yǎng)基配方：10.0 g葡萄糖，1.5 g磷酸氫二鉀，2.0 g磷酸二氫鉀，1.0 g硫酸銨，0.5 g硫酸鎂，16.0 g 瓊脂，1 000 mL去離子水。水瓊脂培養(yǎng)基：15 g瓊脂，1 000 mL 去離子水。水瓊脂培養(yǎng)基用于灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性測定。上述3種培養(yǎng)基均于121 ℃高壓濕熱滅菌20 min，冷卻后貯藏備用。

1.4 果蔬灰霉病病菌對5種殺菌劑的抗藥性測定

采用最低濃度抑制法，嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、咯菌腈、啶酰菌胺分別以1.0、1.0、5.0、0.5、5.0 μg/mL作為鑒別濃度，并以此制備含藥平板。

灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、咯菌腈的抗藥性檢測方法：將待檢測的灰霉病病菌菌株接入PDA培養(yǎng)基平板上，于25 ℃黑暗培養(yǎng)96 h后，取直徑為5 mm的菌片至各含藥培養(yǎng)基平板中，以無藥平板為對照，每個處理3次重復，25 ℃ 黑暗培養(yǎng)72 h后觀察菌株生長情況，與不含藥的培養(yǎng)基平板相比，不能或幾乎不能在該濃度的含藥培養(yǎng)基平板上正常生長的菌株為敏感菌株，能正常生長的菌株為抗性菌株。

灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性檢測方法：參照潘金菊等的方法[15]，檢測啶酰菌胺對灰霉病病菌孢子萌發(fā)的影響。將待檢測的灰霉病病菌菌株接入PDA培養(yǎng)基平板上，于 25 ℃ 黑暗培養(yǎng)5 d至菌絲長滿平板后，黑光燈誘導灰霉病病菌產(chǎn)孢，在25 ℃條件下誘導3～5 d，收集灰霉病病菌的孢子并過濾除去菌絲，調至100倍顯微鏡下每個視野30～40個孢子，將100 μL孢子懸浮液均勻地涂布在含藥的水瓊脂培養(yǎng)基平板上，以無藥水瓊脂培養(yǎng)基平板為對照，每個處理3次重復，25 ℃黑暗培養(yǎng)12 h后，觀察孢子萌發(fā)情況，與不含藥的培養(yǎng)基平板相比，不能或幾乎不能在該濃度的含藥培養(yǎng)基平板上正常生長的菌株為敏感菌株，能正常生長的菌株為抗性菌株。

統(tǒng)計各個地區(qū)各個寄主上灰霉病病菌的抗性菌株的發(fā)生頻率。抗性頻率=抗性菌株數(shù)/測定總菌株數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 長三角地區(qū)果蔬灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗藥性

2013—2014年從長三角的9個地區(qū)、6種不同果蔬作物的病葉或病果上采集分離得到210株灰霉病病菌菌株，采用最低濃度抑制法檢測這些菌株對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利等3種傳統(tǒng)殺菌劑的抗藥性。由表2可知，210株灰霉病病菌菌株對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗藥性較高，抗性頻率分別為68.57%、70.48%、68.10%。比較210株灰霉病病菌菌株的抗藥性結果發(fā)現(xiàn)，采自不同地區(qū)、不同寄主的灰霉病病菌對同種藥劑的抗藥性不同，但采自同一地區(qū)、同種寄主的灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗性頻率總體上差異較小?？傮w來看，在所有采集灰霉病病菌菌株的9個地區(qū)，僅揚州地區(qū)的灰霉病病菌對3種藥劑的抗性頻率均較低，采自鹽城、淮安、鎮(zhèn)江、南通、蘇州、上海、嘉善、寧波等地區(qū)的灰霉病病菌對上述3種傳統(tǒng)藥劑均產(chǎn)生了較高的抗藥性。由表3可知，對于不同寄主上的灰霉病病菌來說，從草莓、黃瓜和番茄的病葉或病果上分離的灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗藥性較高；此外，采自萵苣、瓠瓜上的灰霉病病菌也檢測到了部分抗性菌株，但由于在這2種寄主上分離得到的灰霉病病菌數(shù)量較少，若要準確評價其抗藥性，須進行后續(xù)的樣品采集和抗藥性檢測工作。綜合上述結果發(fā)現(xiàn)，嘧霉胺、多菌靈、腐霉利這3種傳統(tǒng)殺菌劑對長三角不同地區(qū)、不同寄主上的灰霉病病菌的抑制效果較差。

2.2 長三角地區(qū)果蔬灰霉病病菌對咯菌腈和啶酰菌胺的抗藥性

為了綜合評價長三角地區(qū)果蔬灰霉病病菌對傳統(tǒng)殺菌劑和新型殺菌劑的抗藥性情況，指導生產(chǎn)實踐，對采自長三角不同地區(qū)、不同寄主上的210株灰霉病病菌菌株對咯菌腈和啶酰菌胺的抗藥性進行檢測。由表4可知，在210株灰霉病病菌菌株中，未檢測到對咯菌腈產(chǎn)生抗藥性的菌株，說明咯菌腈對灰霉病病菌具有較好的防治效果。關于灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性，檢測啶酰菌胺對孢子萌發(fā)的抑制效果，灰霉病病菌并未能在試驗過程中全部產(chǎn)孢，產(chǎn)孢率較低，經(jīng)過孢子誘導條件的優(yōu)化，仍有59株灰霉病病菌未能成功產(chǎn)孢，產(chǎn)孢率為71.90%，因此最終檢測151株成功產(chǎn)孢的灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性。

表2 長三角不同地區(qū)果蔬灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗性頻率

表3 長三角地區(qū)不同種果蔬作物上灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗性頻率

表4 長三角不同地區(qū)果蔬灰霉病病菌對咯菌腈和啶酰菌胺的抗性頻率

由表4、表5可知，全部檢測的151株成功產(chǎn)孢的灰霉病病菌中，在5.0 μg/mL鑒別濃度下，檢測到23株對啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性的菌株，抗性頻率為15.23%。從不同地區(qū)菌株的抗性頻率來看，不同地區(qū)之間菌株抗性差異較大，淮安、嘉善、寧波等地區(qū)菌株的抗性頻率較高，但由于檢測的菌株數(shù)量較少，須要進行后續(xù)的菌株采集和抗藥性檢測工作，進一步評價這3個地區(qū)菌株的抗藥性；蘇州地區(qū)的菌株抗性頻率較高，達到26.32%；南通、上海等地區(qū)的菌株抗性頻率較低，鹽城、鎮(zhèn)江、揚州等地區(qū)未發(fā)現(xiàn)對啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性的菌株。對于采自不同寄主菌株的抗藥性來說，黃瓜和瓠瓜上的灰霉病病菌抗藥性較高，萵苣和西瓜上未發(fā)現(xiàn)對啶酰菌胺產(chǎn)生抗藥性的菌株，但因菌株數(shù)量較少，須要進行后續(xù)的菌株采集和抗藥性檢測工作，進一步評價上述4種寄主上灰霉病病菌的抗藥性；在草莓和番茄上發(fā)現(xiàn)了抗性菌株，但抗性頻率也較低。綜上所述，在長三角地區(qū)部分地區(qū)不同果蔬品種上檢測到對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的菌株，但抗性頻率較低。

表5 長三角地區(qū)不同種果蔬作物上灰霉病菌對咯菌腈和啶酰菌胺的抗性頻率

3 討論與結論

灰霉病病菌給農業(yè)生產(chǎn)造成了極其嚴重的危害[16-17]，長期以來用于防治果蔬灰霉病的傳統(tǒng)殺菌劑主要包括嘧霉胺、多菌靈、 腐霉利等[18]。這些傳統(tǒng)的化學防治藥劑均已發(fā)現(xiàn)抗性菌株，這些藥劑在農業(yè)生產(chǎn)中的防治效果較差，在國內外關于很多地區(qū)都相繼報道了灰霉病病菌對一些傳統(tǒng)的化學防治藥劑產(chǎn)生了較高的抗藥性[18-20]。

本研究綜合評價了長三角不同地區(qū)不同寄主上的灰霉病病菌對上述3種傳統(tǒng)殺菌劑的抗藥性情況，結果表明，從長三角9個地區(qū)、6種果蔬作物采集分離得到的210株灰霉病病菌，對3種殺菌劑均表現(xiàn)出很高的抗性水平，抗性頻率分別為68.57%、70.48%、68.10%。除揚州地區(qū)外，其他8個地區(qū)的灰霉病病菌均對上述3種殺菌劑產(chǎn)生了較高抗藥性；除采自部分寄主上的灰霉病病菌菌株數(shù)較少外，草莓、黃瓜、番茄上的灰霉病病菌對上述3種殺菌劑均產(chǎn)生了較高抗藥性。表明3種傳統(tǒng)型對長三角地區(qū)灰霉病的防治效果較差，說明在農業(yè)生產(chǎn)中須要選擇新型替代殺菌劑防治果蔬灰霉病。

咯菌腈和啶酰菌胺是防治果蔬灰霉病效果較好的新型殺菌劑[21]，檢測采自長三角地區(qū)的210株灰霉病病菌對這2種殺菌劑的抗藥性，未發(fā)現(xiàn)對咯菌腈產(chǎn)生抗藥性的菌株，說明咯菌腈對灰霉病病菌具有較好的防治效果，對咯菌腈的使用應做好抗性預防工作。

在成功產(chǎn)孢的159株灰霉病病菌菌株中，檢測到對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的菌株有23株，抗性頻率為15.23%，抗性頻率較低；除了部分檢測菌株數(shù)較少的地區(qū)外，蘇州地區(qū)灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性較高，抗性頻率達26.32%；說明啶酰菌胺對灰霉病的總體防治效果較好，但部分地區(qū)的灰霉病病菌對啶酰菌胺已經(jīng)產(chǎn)生了較高的抗藥性。Veloukas等證實，近年來由于該藥劑的大量使用，已經(jīng)導致啶酰菌胺對灰霉病病菌的防治效果下降[22]。紀軍建等的研究也表明，咯菌腈在防治灰霉病時可作為首選藥劑，啶酰菌胺在防治灰霉病時可作為候選藥劑[23]。

綜上所述，咯菌腈在防治灰霉病時效果最好，啶酰菌胺的效果次之，檢測到對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性的菌株，藥劑的田間使用應做好抗性預防工作，同時注意抗藥性暴發(fā)的風險；對不同地區(qū)、不同寄主上的灰霉病病菌的抗藥性進行重點監(jiān)測，指導科學用藥。在藥劑抗性嚴重的地區(qū)或寄主上，應減少該類藥劑的使用次數(shù)或使用量，盡量避免單劑使用。建議停止使用嘧霉胺、多菌靈、腐霉利等高抗藥劑，推薦使用吡咯類殺菌劑，如咯菌腈等，或煙酰胺類殺菌劑，如啶酰菌胺等，但使用時仍應注意藥劑的用量，并注意與不同作用機制的殺菌劑復配或交替使用。