黃連木莖段組培快繁體系的建立

馬媛春， 劉 慧， 薛曉輝， 程宗明

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095； 3.江蘇省海安市林果技術(shù)推廣站，江蘇海安 226600)

黃連木(PistaciachinensisBunge)，英文名為Chinese pistache，屬于漆樹科黃連木屬，別稱黃楝樹、黃連茶、楷樹、藥樹、藥瘤樹等，其樹干挺拔，樹形美觀，樹葉繁茂秀麗，可作為庭陰樹、行道樹及觀賞風(fēng)景樹[1]。此外，黃連木也是一種優(yōu)良的木材、藥用和油料樹種[2]。近年來，人們對(duì)黃連木的研究主要集中于黃連木作為能源樹種的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、作為彩色葉樹種擁有的景觀價(jià)值，以及作為藥用植物的社會(huì)價(jià)值。

常規(guī)的黃連木繁殖方法有籽播育苗、嫁接和扦插等，然而由于黃連木種子外被蠟質(zhì)，屬于深根類型，直接播種發(fā)芽較為困難，需要對(duì)種子進(jìn)行脫蠟處理，然后再進(jìn)行低溫層積處理[3-6]。嫁接和扦插繁殖對(duì)于環(huán)境要求較高，繁殖率較低，已不能滿足消費(fèi)者的需求。

目前，由于江蘇省東部沿海灘涂鹽堿濃度較高，極少有觀賞植物能夠正常生長，為了改變這一現(xiàn)狀，應(yīng)加大力度引進(jìn)具有抗鹽能力的景觀植物。本研究所試種的黃連木來自美國海濱弗吉尼亞州，具有一定的耐鹽能力。組織培養(yǎng)技術(shù)能夠克服常規(guī)繁殖方法繁殖系數(shù)低的缺點(diǎn)，從而降低培養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，實(shí)現(xiàn)良種快繁并達(dá)到產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的客觀需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為一年生黃連木實(shí)生苗(種子來自美國海濱弗吉尼亞州)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的準(zhǔn)備與培養(yǎng) 選取長勢優(yōu)良且健壯的黃連木植株的當(dāng)年生嫩枝，去除葉片，用流水沖洗2 h左右，剪成15～20 cm長的帶腋芽的莖段備用(圖1)。在超凈工作臺(tái)上對(duì)外植體進(jìn)行滅菌處理，先將莖段剪成1～2 cm左右(帶1個(gè)腋芽)的若干小段，用70%乙醇溶液消毒30 s，其間不斷搖晃，之后用無菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞溶液消毒 10 min，消毒后立即用無菌水沖洗5次，最后用無菌濾紙吸干材料表面的水分，準(zhǔn)備好單芽莖段用于接種[7]。

1.2.2 黃連木腋芽的誘導(dǎo)培養(yǎng) 將已處理的無菌莖段斜插于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。所選取的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS、WPM為基本培養(yǎng)基，并添加不同濃度的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)，共組成6種培養(yǎng)基(表1)。將外植體接種到6種培養(yǎng)基上，每瓶2個(gè)，每種培養(yǎng)基接種20瓶。于黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，以減少褐化現(xiàn)象，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，培養(yǎng)3 d后置于光照條件下培養(yǎng)[8]。培養(yǎng)基中蔗糖濃度均為30 g/L，瓊脂濃度為5.6 g/L，pH值為5.8，光照時(shí)間為14 h/d，光照度為100 μmol/(m2·s)，培養(yǎng)濕度為70%～80%。觀察離體芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)情況，20 d后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)調(diào)查。

調(diào)查統(tǒng)計(jì)所用的相關(guān)公式：萌發(fā)率=(萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；褐化率=(褐化莖段數(shù)/接種莖段數(shù))×100%；分化率=[分化數(shù)/(接種數(shù)-褐化數(shù)-污染數(shù))]×100%。

表1 6種培養(yǎng)基組成成分

1.2.3 叢生芽的繼代增殖培養(yǎng) 將在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上已經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d后的嫩芽剪切成1 cm左右的帶芽莖段，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)。以MS、WPM及1/2 WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA、NAA，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種1個(gè)莖段，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后對(duì)材料的增殖系數(shù)、苗高及組培苗的生長狀況進(jìn)行觀察并作統(tǒng)計(jì)分析。以上培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為5.6 g/L，pH值均為5.8，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照時(shí)間為14 h/d，光照度為100 μmol/(m2·s)。

調(diào)查增殖系數(shù)、苗高、生長形態(tài)等，相關(guān)公式如下：增殖系數(shù)=調(diào)查時(shí)的芽數(shù)-接種芽數(shù)；苗高=調(diào)查時(shí)的苗高-接種時(shí)的苗高。

1.2.4 組培苗的生根培養(yǎng) 以繼代培養(yǎng)的組培苗為試驗(yàn)材料，選取生長健壯的組培苗，將增殖生成的叢生芽分株，每個(gè)芽為1株苗，接種到生根培養(yǎng)基上。每個(gè)培養(yǎng)基接種20株，重復(fù)3次，50 d后開始調(diào)查統(tǒng)計(jì)每種培養(yǎng)基的生根苗數(shù)及平均生根數(shù)。培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂濃度為 5.6 g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照時(shí)間為14 h/d，光照度為100 μmol/(m2·s)。

1.2.5 生根組培苗的馴化與移栽

1.2.5.1 馴化 將生根良好、根系健壯的組培苗瓶蓋擰松，放置在無菌環(huán)境下3 d后，每2 d加入微量無菌水，光照度設(shè)為100 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間設(shè)為12 h/d。并且逐漸開蓋，第10天時(shí)徹底開蓋，并及時(shí)補(bǔ)充適當(dāng)水分(無菌水)。

1.2.5.2 移栽 將未污染、長勢良好的馴化組培苗取出，用無菌水沖洗附著在根系上的培養(yǎng)基，勿傷及根部，接著修剪基部葉片，保留頂端長勢好的復(fù)葉3～5張，然后移栽至基質(zhì)中，放入人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。所選基質(zhì)為蛭石、草炭土、珍珠巖，其體積比為9 ∶3 ∶1，放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)于 121 ℃ 滅菌30 min。人工氣候培養(yǎng)箱中的溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為80%，光照度為100 μmol/(m2·s)，光照時(shí)間為 12 h/d。移栽7 d后進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果

通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用MS、WPM、1/2 WPM為基本培養(yǎng)基時(shí)，未取得腋芽萌發(fā)效果。由此可以看出，基本培養(yǎng)基不適合用于黃連木的腋芽萌發(fā)試驗(yàn)。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，添加細(xì)胞分裂素類生長調(diào)節(jié)劑6-BA以及細(xì)胞生長素NAA和IBA。由表2可以明顯看出，在黃連木腋芽誘導(dǎo)時(shí)期，基本培養(yǎng)基為MS的3種培養(yǎng)基褐化率較高，萌發(fā)率極低，基本無叢生芽；當(dāng)培養(yǎng)基為1/2 WPM+1.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.10 mg/L IBA時(shí)，叢生芽較多，葉色較嫩綠，節(jié)間較長，生長粗壯，分化率達(dá)到91.7%(圖2)。通過6種培養(yǎng)基的對(duì)比可知，影響黃連木腋芽誘導(dǎo)的因素主次順序?yàn)榛九囵B(yǎng)基>細(xì)胞分裂素>細(xì)胞生長素，因此可見，細(xì)胞分裂素類生長調(diào)節(jié)劑6-BA的濃度對(duì)分化率的影響較大，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到 1.5 mg/L 時(shí)，分化率最高，長勢最好。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)黃連木腋芽萌發(fā)的影響

2.2 叢生芽的繼代增殖培養(yǎng)結(jié)果

在黃連木繼代增殖培養(yǎng)前期，經(jīng)過不間斷的反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分裂素與細(xì)胞生長素共同作用的情況下，叢生芽的增殖數(shù)較多，當(dāng)細(xì)胞分裂素類生長調(diào)節(jié)劑6-BA的濃度達(dá)到3.5 mg/L時(shí)，增殖倍數(shù)最高。由表3可以看出，在黃連木繼代增殖培養(yǎng)時(shí)期，在3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，芽的增殖倍數(shù)和生長情況存在差異，在WPM+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基上的叢生芽較少，節(jié)間短，畸形苗多，玻璃化嚴(yán)重；在1/2 WPM+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基上的叢生芽密集，微型化，畸形苗較多，玻璃化嚴(yán)重(圖3)； 而在培養(yǎng)基MS+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 培養(yǎng)基上的叢生芽較多，苗生長健壯，生長速度較快(圖4)。綜合這3種培養(yǎng)基的研究結(jié)果以及本試驗(yàn)的前期研究可以看出，除了細(xì)胞分裂素類和生長素類生長調(diào)節(jié)劑的用量配比對(duì)黃連木繼代增殖比較重要以外，基本培養(yǎng)基的選用對(duì)于黃連木繼代增殖也極為重要。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)篩選出的適宜黃連木繼代增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)黃連木繼代增殖的影響

2.3 組培苗的生根培養(yǎng)結(jié)果

在試驗(yàn)前期，采用MS為基本培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，未取得生根效果。隨后，以1/2 MS、WPM、1/2 WPM為基本培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，以WPM為基本培養(yǎng)基時(shí)無生根效果，因此可以得出結(jié)論：降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，有利于不定根的發(fā)生[9]。外源生長素對(duì)生根有一定的促進(jìn)作用，但外當(dāng)源生長素的濃度超過一定限度時(shí)，組培苗的生長又呈下降趨勢。當(dāng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，單獨(dú)添加不同濃度的NAA誘導(dǎo)黃連木苗生根， 發(fā)現(xiàn)其生根效果不佳；當(dāng)NAA濃度為0.02 mg/L時(shí)，生根率最高；而當(dāng)NAA濃度在0.2 mg/L及以上時(shí)，基本無發(fā)根(表4)。

在以上試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，添加IBA與NAA組合作用，繼續(xù)篩選適合生根的培養(yǎng)基。由表5可以看出，IBA能夠較好地誘導(dǎo)生根，但是濃度大于1 mg/L時(shí)，效果下降；基本培養(yǎng)基為1/2 WPM時(shí)比1/2 MS的生根效果好。培養(yǎng)基為1/2 WPM+0.02 mg/L NAA+1 mg/L IBA時(shí)生根效果最佳(圖5)，培養(yǎng)基為1/2 WPM+0.02 mg/L NAA+2 mg/L IBA時(shí)，根系粗短，不適宜移栽(圖6)。

表4 不同濃度NAA對(duì)生根的影響

表5 不同培養(yǎng)基生根誘導(dǎo)的影響

2.4 組培苗的馴化與移栽

將黃連木生根組培苗在馴化10 d后移栽，然后于人工氣候培養(yǎng)箱中放置20 d，再過渡到自然環(huán)境下生長，苗木移栽成活率可達(dá)67%以上(圖7)。

3 結(jié)論與討論

黃連木組織培養(yǎng)難度較大，在初代階段的褐化率較高，燒苗現(xiàn)象嚴(yán)重；在繼代時(shí)期，組培苗玻璃化嚴(yán)重，易產(chǎn)生畸形苗，從而影響試驗(yàn)的進(jìn)行；在誘導(dǎo)生根階段，大部分根系呈黑色，且組培苗生長緩慢，總體生根率不高[10]。利用黃連木莖段進(jìn)行組培快繁，篩選出的最佳腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 WPM+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA。在繼代增殖時(shí)期，MS+3.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基的增殖效果最佳，生根效果以1/2 WPM+0.02 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA配方的培養(yǎng)基較好。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基本培養(yǎng)基的選用對(duì)于黃連木初代腋芽誘導(dǎo)極為重要；細(xì)胞分裂素類生長調(diào)節(jié)劑與細(xì)胞生長素的配比是影響黃連木繼代增殖的重要因素；影響黃連木生根培養(yǎng)的因素很多，包括無機(jī)鹽濃度、是否添加細(xì)胞分裂素、不同細(xì)胞生長素的作用、多種細(xì)胞生長素的協(xié)調(diào)作用配比等[11-12]。

黃連木組培快繁體系的建立，大大縮短了繁殖周期，降低了生產(chǎn)成本，也能夠解決種子繁殖所帶來的觀賞形態(tài)不一的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)建立了可供海濱生長的黃連木從腋芽誘導(dǎo)、增殖、生根、煉苗到移栽的快繁體系，從而為黃連木工廠化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。