基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用

吳碧濤，蔣文強(qiáng) （綿陽市中心醫(yī)院檢驗科，四川 綿陽 621000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見的自身免疫性疾病，其病因不明，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，診斷困難，治療受限。蛋白質(zhì)組學(xué)研究通過差異蛋白篩選，可發(fā)現(xiàn)隱藏于疾病背后的確切病理機(jī)制，找到新的、更加敏感而特異的生物標(biāo)志物，提供藥物治療新靶點。本文僅就基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液、尿液、唾液等體液檢測中的應(yīng)用作一簡單綜述。

1 系統(tǒng)性紅斑狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見的慢性自身免疫性炎癥性結(jié)締組織疾病，起病隱匿，臨床表現(xiàn)多樣，常表現(xiàn)為復(fù)發(fā)加重與緩解交替進(jìn)行的病程?？汕址复蠖鄶?shù)的組織器官，包括心、腦、皮膚、關(guān)節(jié)和腎臟等［1］。值得注意的是，該病多發(fā)于育齡期女性，男女患病比例約為1∶9，且在白種人中發(fā)病率更高［2］。血清中出現(xiàn)高滴度的以抗核抗體為主的自身抗體為該病的又一特點，這些抗體沉積于組織，形成免疫復(fù)合物，激活免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致組織器官損傷［3］。盡管對SLE的研究已較深入，但其卻確的病因?qū)W及病理機(jī)制還知之甚少。普遍認(rèn)為，基因、表觀遺傳、環(huán)境、性激素、免疫調(diào)節(jié)等因素，以及它們彼此之間的相互作用，均參與了SLE的發(fā)病［1］。目前，對SLE的明確診斷仍比較困難，患者需符合由美國風(fēng)濕病學(xué)會（American College of Rheumatology，ACR）提出的11項臨床及實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)中的至少4項方能被診斷為SLE患者［4-5］。然而，這些標(biāo)準(zhǔn)只適用于對患者的分類，對于僅有早期征兆的患者可能漏診。來自第三方實驗的數(shù)據(jù)顯示僅有60%的SLE患者滿足ACR標(biāo)準(zhǔn)［6］。盡管將激素和免疫抑制劑用于SLE治療后，其預(yù)后得到了很大改善，但目前尚無徹底根治辦法。基于SLE病因不明，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，診斷困難，治療受限，因此迫切需要發(fā)現(xiàn)隱藏于疾病背后的確切病理機(jī)制，找到新的、更加敏感而特異的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)藥物治療新靶點［7］。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后，生命科學(xué)前沿及熱點研究領(lǐng)域的重要代表之一［8-11］。1994年澳大利亞Macquarie大學(xué)的科學(xué)家Wilkins等首次提出蛋白質(zhì)組（proteome）的概念［12］，是指一個基因組、細(xì)胞或組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)［13］，也可說是指細(xì)胞或機(jī)體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動變化規(guī)律。而研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的科學(xué)被稱為蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）。它以蛋白質(zhì)組為研究對象，在整體水平上研究存在于細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)的所有蛋白質(zhì)，包括蛋白質(zhì)的組成、表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、翻譯后加工修飾、生物功能以及蛋白質(zhì)之間的相互作用及其變化規(guī)律等。據(jù)此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容可分為：表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、比較蛋白質(zhì)組學(xué)以及功能蛋白質(zhì)組學(xué)［14］。研究蛋白質(zhì)組學(xué)的常用技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及相對和絕對定量同位素標(biāo)記技術(shù)等［15］。蛋白質(zhì)分離技術(shù)主要包括雙向凝膠電泳（2-DE）、雙向熒光差異電泳以及液相色譜（LC）等技術(shù)。目前最普遍采用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)是質(zhì)譜分析技術(shù)。

3 生物質(zhì)譜

質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中起著至關(guān)重要的作用，是最關(guān)鍵的蛋白鑒定技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)是指通過質(zhì)譜分析儀鑒定經(jīng)過各種途徑分離的蛋白質(zhì)，其基本原理是樣品經(jīng)離子化后，據(jù)不同離子的質(zhì)荷比（m／z）來分離鑒定樣品的相對分子質(zhì)量［16］。質(zhì)譜儀由進(jìn)樣器、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器和分析系統(tǒng)五部分組成。其核心部分包括：離子源、質(zhì)量分析器和離子檢測器［17］。按質(zhì)量分析器種類不同質(zhì)譜儀可分為不同的類型，如：飛行時間質(zhì)譜（time of flight mass spectrometry，TOF-MS）、表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（surface enhanced laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（Fourier-transform mass spectrometry，F(xiàn)T-MS）、線性離子阱質(zhì)譜（Linear ion traps in mass spectrometry，LIT）、四級桿離子阱質(zhì)譜儀（quatrupole ion trap mass spectrometry）以及 Obitrap等［18］。目前常用的質(zhì)譜包括基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）。MALDI（前者）利用激光脈沖從干燥結(jié)晶的基質(zhì)中氣化被分析物并使之帶電，常用于分析高分子量的蛋白，測定的是肽質(zhì)量指紋比對；ESI（后者）常與液相分離工具相連，將被分析物從溶液中離子化，檢測靈敏度更高，可達(dá)飛克級水平，測定的是肽碎片指紋比對［16，19-21］。

4 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在SLE中的應(yīng)用

4.1 SLE患者血液（血清及PBMC）蛋白質(zhì)組學(xué)研究：血清和外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）可以被容易且無侵襲性地獲取。兩種基質(zhì)都能對來自機(jī)體不同的信號，如炎癥狀態(tài)，做出快速的反應(yīng)［22］。盡管近年來在有關(guān)SLE的研究中，外周血單個核細(xì)胞被廣泛關(guān)注［22，23-29］，血清仍是最廣泛應(yīng)用的血液成分。Pinna S等利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析提示幾種蛋白質(zhì)在SLE患者的PBMC中被異常表達(dá)［22］。在這些蛋白之中，PRDX2可能被用于候選生物標(biāo)志物或進(jìn)一步研究的靶蛋白。同時在血清中，他們發(fā)現(xiàn)與健康對照者相比，SLE組血清聚集蛋白水平升高了，但這個升高并無統(tǒng)計學(xué)意義。Φstergaard O等使用胰蛋白酶消化后，將循環(huán)微粒（circulating microparticles，MP蛋白）通過LC-MS鑒定并定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組系統(tǒng)性硬化癥患者和健康志愿者相比，在SLE患者血清組找到具有差異的MP蛋白超過1 000種，并發(fā)現(xiàn)SLE-MPs（被建議稱為Luposomes）亞群對于SLE具有高度特異性［30］。在SLE-MPs中，血小板蛋白和線粒體蛋白顯著減少，細(xì)胞骨架蛋白紊亂，而糖酵解酶和凋亡蛋白顯著增加。在Kazemipour N及其團(tuán)隊［31］的研究中，實驗被分為SLE組與健康對照者組，各組血清中的高豐度蛋白通過使用一種特殊的試劑盒去除后，繼之用2-DE和MALDI-TOF／TOF-MS分離鑒定血清蛋白，結(jié)果在試驗組找到15個差異表達(dá)的蛋白點，包括7種上調(diào)和8種下調(diào)的蛋白。這些蛋白點經(jīng)進(jìn)一步鑒定后被歸類為3組，包括角蛋白、載脂蛋白和白蛋白以及單獨的蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、觸珠蛋白和凝血酶原。

4.2 SLE患者尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究：狼瘡腎炎（Lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因之一［32］。高達(dá)50%的SLE成人患者在疾病早期即有腎臟受累的征兆或者最終導(dǎo)致明顯的腎臟疾病［33］。目前，傳統(tǒng)的用于檢測和評估狼瘡腎炎的實驗室標(biāo)志物包括蛋白尿、尿蛋白／肌酐比值、肌酐清除率、抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體、補(bǔ)體水平等［34］，但由于它們或者特異性不高，或者敏感性不夠，其臨床應(yīng)用效果并不令人滿意。盡管腎臟活檢仍然是診斷和分類腎臟炎癥和瘢痕程度的金標(biāo)準(zhǔn)［34］，由于該方法為有創(chuàng)性的檢查，其操作具有風(fēng)險性以及給患者帶來不適，因此利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究狼瘡腎炎患者尿液被大力推廣。一方面，尿液標(biāo)本容易獲取，可反復(fù)、連續(xù)獲得；另一方面，尿液直接來源于狼瘡腎炎的受累組織。因此，相較于血液標(biāo)本，在狼瘡腎炎患者的體液標(biāo)本中，尿液顯示出更廣闊的應(yīng)用前景。Wei R等［33］采用GC-MS的方法對比研究了狼瘡腎炎、非腎炎性SLE以及健康對照者的尿液蛋白質(zhì)組學(xué)，他們的試驗發(fā)現(xiàn)與非腎炎性SLE患者組相比，狼瘡腎炎組有70種膠原蛋白肽顯著改變，與健康對照組比，狼瘡腎炎組有230種膠原蛋白肽顯著改變，這些差異蛋白被定義為“狼瘡腎炎膠原蛋白肽”。Aggarwal A及其研究團(tuán)隊［35］根據(jù)SLE疾病活動度指數(shù)將患者分為活動性腎炎患者（AR）、活動性非腎炎患者（ANR）或非活動性組（ID），將來自各組的患者尿液蛋白通過2-DE分離，繼之用MALDI-TOF-MS／MS方法鑒定。篩選出的生物標(biāo)志物用ELISA的方法驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：尿液蛋白 alpha-1 anti-chymotrypsin（ACT），haptoglobin（HAP）以及retinol binding protein（RBP）在活動性腎炎患者組被檢測到，而非活動性組未檢測到。Somparn P等用ESI-Q-TOF MS／MS的方法研究狼瘡腎炎潛在的生物標(biāo)志物，在所有升高的蛋白中，Prostaglandin H2D-isomerase（PGDS）成為了感興趣的標(biāo)志物［36］。PGDS催化PGH2的異構(gòu)化產(chǎn)生Prostaglandin D2（PGD2），PGD2參與血小板聚集、過敏、炎性反應(yīng)以及化學(xué)趨化作用。他們的研究結(jié)果顯示：與非LN腎小球疾病和健康對照組相比，成年人及兒童活動性LN患者尿液PGDS表現(xiàn)出顯著的升高。

4.3 SLE患者唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究：研究發(fā)現(xiàn)，大約10%～20%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者是在他們生命的前10年被首次診斷為該病［37］。該病鮮有在5歲之前發(fā)病，出現(xiàn)臨床癥狀的平均年齡是12.1歲［38-40］。在臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)改變及治療方法方面成年人與兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡并無明顯不同，但比起成年人，兒童患者通常經(jīng)歷更高的疾病活動度以及進(jìn)展性更強(qiáng)的疾病過程［41-42］。報道稱，在兒科疾病中，自身免疫性風(fēng)濕性疾病是最常見的發(fā)病和死亡原因。考慮到在兒童患者中該病較高的發(fā)病率以及死亡率，其早期診斷就顯得尤為重要。傳統(tǒng)地，患者血清中系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)自身抗體檢測扮演了非常重要的角色。然而，由于血液采樣可能給患者帶來不適，尤其是兒童，因此，新的侵入性更小的，甚至非侵入性的技術(shù)或方法對于兒科患者就顯得尤為重要。從這個角度出發(fā)，唾液樣本具有許多優(yōu)勢，如易獲得性、快速收集、采樣過程無痛苦無風(fēng)險等。最新研究顯示，唾液成分的變化與機(jī)體病理生理狀態(tài)密切相關(guān)，被視為“人體健康狀態(tài)的窗口”。唾液被認(rèn)為是一個潛在的生物標(biāo)志物儲存庫［43］。分析唾液成分變化可有效反應(yīng)機(jī)體生理和病理狀態(tài)。在這一背景下，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示出了誘人的前景。盡管至目前為止，該領(lǐng)域的研究數(shù)量有限，但相信隨著研究的深入，更多的關(guān)于唾液蛋白質(zhì)組學(xué)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究成果將會被陸續(xù)報道。

5 總結(jié)與展望

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)知識和技術(shù)的出現(xiàn)為研究自身免疫性疾病提供了新的視角。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是自身免疫性疾病的重要代表。以其高通量、高敏感性及高特異性為特點，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的相關(guān)研究中，包括闡明其病理生理機(jī)制，輔助疾病早期診斷，尋找新的診斷用生物標(biāo)志物以及發(fā)現(xiàn)可能的藥物作用靶標(biāo)。我們相信，這些研究將有助于進(jìn)一步提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的診斷及治療水平。

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