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    基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用

    2018-02-12 19:09:42吳碧濤蔣文強(qiáng)綿陽市中心醫(yī)院檢驗科四川綿陽621000
    吉林醫(yī)學(xué) 2018年4期
    關(guān)鍵詞:狼瘡紅斑狼瘡腎炎

    吳碧濤,蔣文強(qiáng) (綿陽市中心醫(yī)院檢驗科,四川 綿陽 621000)

    系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種常見的自身免疫性疾病,其病因不明,臨床表現(xiàn)復(fù)雜,診斷困難,治療受限。蛋白質(zhì)組學(xué)研究通過差異蛋白篩選,可發(fā)現(xiàn)隱藏于疾病背后的確切病理機(jī)制,找到新的、更加敏感而特異的生物標(biāo)志物,提供藥物治療新靶點。本文僅就基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液、尿液、唾液等體液檢測中的應(yīng)用作一簡單綜述。

    1 系統(tǒng)性紅斑狼瘡

    系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種常見的慢性自身免疫性炎癥性結(jié)締組織疾病,起病隱匿,臨床表現(xiàn)多樣,常表現(xiàn)為復(fù)發(fā)加重與緩解交替進(jìn)行的病程??汕址复蠖鄶?shù)的組織器官,包括心、腦、皮膚、關(guān)節(jié)和腎臟等[1]。值得注意的是,該病多發(fā)于育齡期女性,男女患病比例約為1∶9,且在白種人中發(fā)病率更高[2]。血清中出現(xiàn)高滴度的以抗核抗體為主的自身抗體為該病的又一特點,這些抗體沉積于組織,形成免疫復(fù)合物,激活免疫系統(tǒng),最終導(dǎo)致組織器官損傷[3]。盡管對SLE的研究已較深入,但其卻確的病因?qū)W及病理機(jī)制還知之甚少。普遍認(rèn)為,基因、表觀遺傳、環(huán)境、性激素、免疫調(diào)節(jié)等因素,以及它們彼此之間的相互作用,均參與了SLE的發(fā)病[1]。目前,對SLE的明確診斷仍比較困難,患者需符合由美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology,ACR)提出的11項臨床及實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)中的至少4項方能被診斷為SLE患者[4-5]。然而,這些標(biāo)準(zhǔn)只適用于對患者的分類,對于僅有早期征兆的患者可能漏診。來自第三方實驗的數(shù)據(jù)顯示僅有60%的SLE患者滿足ACR標(biāo)準(zhǔn)[6]。盡管將激素和免疫抑制劑用于SLE治療后,其預(yù)后得到了很大改善,但目前尚無徹底根治辦法。基于SLE病因不明,臨床表現(xiàn)復(fù)雜,診斷困難,治療受限,因此迫切需要發(fā)現(xiàn)隱藏于疾病背后的確切病理機(jī)制,找到新的、更加敏感而特異的生物標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)藥物治療新靶點[7]。

    2 蛋白質(zhì)組學(xué)

    蛋白質(zhì)組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后,生命科學(xué)前沿及熱點研究領(lǐng)域的重要代表之一[8-11]。1994年澳大利亞Macquarie大學(xué)的科學(xué)家Wilkins等首次提出蛋白質(zhì)組(proteome)的概念[12],是指一個基因組、細(xì)胞或組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[13],也可說是指細(xì)胞或機(jī)體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動變化規(guī)律。而研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律的科學(xué)被稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)。它以蛋白質(zhì)組為研究對象,在整體水平上研究存在于細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)的所有蛋白質(zhì),包括蛋白質(zhì)的組成、表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、翻譯后加工修飾、生物功能以及蛋白質(zhì)之間的相互作用及其變化規(guī)律等。據(jù)此,蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容可分為:表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、比較蛋白質(zhì)組學(xué)以及功能蛋白質(zhì)組學(xué)[14]。研究蛋白質(zhì)組學(xué)的常用技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及相對和絕對定量同位素標(biāo)記技術(shù)等[15]。蛋白質(zhì)分離技術(shù)主要包括雙向凝膠電泳(2-DE)、雙向熒光差異電泳以及液相色譜(LC)等技術(shù)。目前最普遍采用的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)是質(zhì)譜分析技術(shù)。

    3 生物質(zhì)譜

    質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中起著至關(guān)重要的作用,是最關(guān)鍵的蛋白鑒定技術(shù)。質(zhì)譜技術(shù)是指通過質(zhì)譜分析儀鑒定經(jīng)過各種途徑分離的蛋白質(zhì),其基本原理是樣品經(jīng)離子化后,據(jù)不同離子的質(zhì)荷比(m/z)來分離鑒定樣品的相對分子質(zhì)量[16]。質(zhì)譜儀由進(jìn)樣器、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器和分析系統(tǒng)五部分組成。其核心部分包括:離子源、質(zhì)量分析器和離子檢測器[17]。按質(zhì)量分析器種類不同質(zhì)譜儀可分為不同的類型,如:飛行時間質(zhì)譜(time of flight mass spectrometry,TOF-MS)、表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(Fourier-transform mass spectrometry,F(xiàn)T-MS)、線性離子阱質(zhì)譜(Linear ion traps in mass spectrometry,LIT)、四級桿離子阱質(zhì)譜儀(quatrupole ion trap mass spectrometry)以及 Obitrap等[18]。目前常用的質(zhì)譜包括基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)。MALDI(前者)利用激光脈沖從干燥結(jié)晶的基質(zhì)中氣化被分析物并使之帶電,常用于分析高分子量的蛋白,測定的是肽質(zhì)量指紋比對;ESI(后者)常與液相分離工具相連,將被分析物從溶液中離子化,檢測靈敏度更高,可達(dá)飛克級水平,測定的是肽碎片指紋比對[16,19-21]。

    4 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在SLE中的應(yīng)用

    4.1 SLE患者血液(血清及PBMC)蛋白質(zhì)組學(xué)研究:血清和外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)可以被容易且無侵襲性地獲取。兩種基質(zhì)都能對來自機(jī)體不同的信號,如炎癥狀態(tài),做出快速的反應(yīng)[22]。盡管近年來在有關(guān)SLE的研究中,外周血單個核細(xì)胞被廣泛關(guān)注[22,23-29],血清仍是最廣泛應(yīng)用的血液成分。Pinna S等利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析提示幾種蛋白質(zhì)在SLE患者的PBMC中被異常表達(dá)[22]。在這些蛋白之中,PRDX2可能被用于候選生物標(biāo)志物或進(jìn)一步研究的靶蛋白。同時在血清中,他們發(fā)現(xiàn)與健康對照者相比,SLE組血清聚集蛋白水平升高了,但這個升高并無統(tǒng)計學(xué)意義。Φstergaard O等使用胰蛋白酶消化后,將循環(huán)微粒(circulating microparticles,MP蛋白)通過LC-MS鑒定并定量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與對照組系統(tǒng)性硬化癥患者和健康志愿者相比,在SLE患者血清組找到具有差異的MP蛋白超過1 000種,并發(fā)現(xiàn)SLE-MPs(被建議稱為Luposomes)亞群對于SLE具有高度特異性[30]。在SLE-MPs中,血小板蛋白和線粒體蛋白顯著減少,細(xì)胞骨架蛋白紊亂,而糖酵解酶和凋亡蛋白顯著增加。在Kazemipour N及其團(tuán)隊[31]的研究中,實驗被分為SLE組與健康對照者組,各組血清中的高豐度蛋白通過使用一種特殊的試劑盒去除后,繼之用2-DE和MALDI-TOF/TOF-MS分離鑒定血清蛋白,結(jié)果在試驗組找到15個差異表達(dá)的蛋白點,包括7種上調(diào)和8種下調(diào)的蛋白。這些蛋白點經(jīng)進(jìn)一步鑒定后被歸類為3組,包括角蛋白、載脂蛋白和白蛋白以及單獨的蛋白質(zhì),如轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、觸珠蛋白和凝血酶原。

    4.2 SLE患者尿液蛋白質(zhì)組學(xué)研究:狼瘡腎炎(Lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥,也是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因之一[32]。高達(dá)50%的SLE成人患者在疾病早期即有腎臟受累的征兆或者最終導(dǎo)致明顯的腎臟疾病[33]。目前,傳統(tǒng)的用于檢測和評估狼瘡腎炎的實驗室標(biāo)志物包括蛋白尿、尿蛋白/肌酐比值、肌酐清除率、抗雙鏈DNA(ds-DNA)抗體、補(bǔ)體水平等[34],但由于它們或者特異性不高,或者敏感性不夠,其臨床應(yīng)用效果并不令人滿意。盡管腎臟活檢仍然是診斷和分類腎臟炎癥和瘢痕程度的金標(biāo)準(zhǔn)[34],由于該方法為有創(chuàng)性的檢查,其操作具有風(fēng)險性以及給患者帶來不適,因此利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究狼瘡腎炎患者尿液被大力推廣。一方面,尿液標(biāo)本容易獲取,可反復(fù)、連續(xù)獲得;另一方面,尿液直接來源于狼瘡腎炎的受累組織。因此,相較于血液標(biāo)本,在狼瘡腎炎患者的體液標(biāo)本中,尿液顯示出更廣闊的應(yīng)用前景。Wei R等[33]采用GC-MS的方法對比研究了狼瘡腎炎、非腎炎性SLE以及健康對照者的尿液蛋白質(zhì)組學(xué),他們的試驗發(fā)現(xiàn)與非腎炎性SLE患者組相比,狼瘡腎炎組有70種膠原蛋白肽顯著改變,與健康對照組比,狼瘡腎炎組有230種膠原蛋白肽顯著改變,這些差異蛋白被定義為“狼瘡腎炎膠原蛋白肽”。Aggarwal A及其研究團(tuán)隊[35]根據(jù)SLE疾病活動度指數(shù)將患者分為活動性腎炎患者(AR)、活動性非腎炎患者(ANR)或非活動性組(ID),將來自各組的患者尿液蛋白通過2-DE分離,繼之用MALDI-TOF-MS/MS方法鑒定。篩選出的生物標(biāo)志物用ELISA的方法驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn):尿液蛋白 alpha-1 anti-chymotrypsin(ACT),haptoglobin(HAP)以及retinol binding protein(RBP)在活動性腎炎患者組被檢測到,而非活動性組未檢測到。Somparn P等用ESI-Q-TOF MS/MS的方法研究狼瘡腎炎潛在的生物標(biāo)志物,在所有升高的蛋白中,Prostaglandin H2D-isomerase(PGDS)成為了感興趣的標(biāo)志物[36]。PGDS催化PGH2的異構(gòu)化產(chǎn)生Prostaglandin D2(PGD2),PGD2參與血小板聚集、過敏、炎性反應(yīng)以及化學(xué)趨化作用。他們的研究結(jié)果顯示:與非LN腎小球疾病和健康對照組相比,成年人及兒童活動性LN患者尿液PGDS表現(xiàn)出顯著的升高。

    4.3 SLE患者唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究:研究發(fā)現(xiàn),大約10%~20%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者是在他們生命的前10年被首次診斷為該病[37]。該病鮮有在5歲之前發(fā)病,出現(xiàn)臨床癥狀的平均年齡是12.1歲[38-40]。在臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)改變及治療方法方面成年人與兒童系統(tǒng)性紅斑狼瘡并無明顯不同,但比起成年人,兒童患者通常經(jīng)歷更高的疾病活動度以及進(jìn)展性更強(qiáng)的疾病過程[41-42]。報道稱,在兒科疾病中,自身免疫性風(fēng)濕性疾病是最常見的發(fā)病和死亡原因。考慮到在兒童患者中該病較高的發(fā)病率以及死亡率,其早期診斷就顯得尤為重要。傳統(tǒng)地,患者血清中系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)自身抗體檢測扮演了非常重要的角色。然而,由于血液采樣可能給患者帶來不適,尤其是兒童,因此,新的侵入性更小的,甚至非侵入性的技術(shù)或方法對于兒科患者就顯得尤為重要。從這個角度出發(fā),唾液樣本具有許多優(yōu)勢,如易獲得性、快速收集、采樣過程無痛苦無風(fēng)險等。最新研究顯示,唾液成分的變化與機(jī)體病理生理狀態(tài)密切相關(guān),被視為“人體健康狀態(tài)的窗口”。唾液被認(rèn)為是一個潛在的生物標(biāo)志物儲存庫[43]。分析唾液成分變化可有效反應(yīng)機(jī)體生理和病理狀態(tài)。在這一背景下,系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示出了誘人的前景。盡管至目前為止,該領(lǐng)域的研究數(shù)量有限,但相信隨著研究的深入,更多的關(guān)于唾液蛋白質(zhì)組學(xué)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究成果將會被陸續(xù)報道。

    5 總結(jié)與展望

    近年來,蛋白質(zhì)組學(xué)知識和技術(shù)的出現(xiàn)為研究自身免疫性疾病提供了新的視角。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是自身免疫性疾病的重要代表。以其高通量、高敏感性及高特異性為特點,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的相關(guān)研究中,包括闡明其病理生理機(jī)制,輔助疾病早期診斷,尋找新的診斷用生物標(biāo)志物以及發(fā)現(xiàn)可能的藥物作用靶標(biāo)。我們相信,這些研究將有助于進(jìn)一步提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的診斷及治療水平。

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