輪狀病毒侵入機制研究進展

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(黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，黑龍江 齊齊哈爾161006)

0 引言

輪狀病毒(Rotavirus，RV)是人畜共患腹瀉病的重要病原之一，能夠引起嬰幼兒感染甚至死亡，也能夠引起仔豬嚴重脫水性腹瀉。該病已經嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。目前尚無治療該病的特效藥，疫苗接種是預防該病的最主要措施，但國內外現(xiàn)有的幾種疫苗的免疫效果差強人意。因此，迫切需要發(fā)展有效的疫苗和抗病毒策略，這就需要進行大量基礎研究，進而對RV與宿主細胞相互作用的分子機制進行更深入理解，鑒于此，就RV的分子侵入機制進行了研究進展綜述，旨在為進一步基礎研究奠定基礎。

1 病原學

RV為呼腸孤病毒科輪狀病毒屬成員，為無囊膜的雙鏈RNA病毒，由3層同心蛋白包裹11個分節(jié)段雙鏈RNA，編碼6種結構蛋白(VP1～VP4，VP6和VP7)和6種非結構蛋白(NSP1～NSP6)。VP4經胰酶裂解為VP8*和VP5*蛋白。其中VP8*蛋白的抗原表位含有唾液酸結合區(qū)域，這一區(qū)域對于需要唾液酸進行感染的RV來說是至關重要。VP5*含有一個能夠增加細胞膜通透性，從而提高病毒侵入細胞能力的區(qū)域，這與有囊膜病毒(如流感病毒)類似。VP5*包含了病毒融合功能區(qū)域，負責病毒侵入。VP4和VP7蛋白都與最初病毒與宿主細胞間的相互作用有關。它們通過順序性、特異性的與宿主細胞表面不同受體分子相互作用觸發(fā)細胞信號級聯(lián)放大而促進RV侵入宿主細胞，在病毒侵入宿主細胞過程中擔當重要角色[1]。

2 侵入機制

RV目前可能有兩種侵入途徑，一種是直接穿透細胞膜途徑，另一種是內吞途徑。內吞途徑又分為網(wǎng)格蛋白依賴的內吞途徑、非網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白依賴的內吞途徑和巨胞飲。病毒侵入宿主細胞作為病毒感染宿主的第一步，在病毒的整個生活周期中非常重要，同時也是研究者們制定抗病毒研究策略的重要靶標和方向。

2.1 直接穿透細胞膜途徑

基于電鏡數(shù)據(jù)和觀察到的RV感染會誘導細胞膜的快速滲透，研究者提出直接的細胞膜穿透作為RV侵入宿主細胞的機制。通常RV經腸道上皮細胞中的胰酶裂解被激活，從而提高其感染性。但有研究顯示，未經胰酶激活RRV 株輪狀病毒同樣可以感染 MA104 細胞，所以推測其可能通過其他侵入途徑侵入宿主細胞。通過使用阻止內體酸化的抑制劑(如 NH4Cl)或阻止內吞泡的胞內運輸?shù)囊种苿┚荒芤种芌V感染；通過生化試驗分析及電鏡觀察證明，RV的外層蛋白位于質膜表面，而雙層衣殼的病毒粒子被內化[2]。以上結果都支持了RV的直接侵入假說。

2.2 內吞途徑

RV侵入宿主細胞是一個多步驟的需要多種受體分子協(xié)調的過程。人輪狀病毒如Wa、DS-1、WI69 株和動物輪狀病毒如UK、YM、TFR-41、SA11-4S、nar3株通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用和內體的酸化侵入宿主細胞，而猴輪狀病毒RRV株，通過不依賴于網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白的內吞途徑侵入宿主細胞。早期對RV感染細胞的電鏡研究顯示，內吞作用為病毒內化的途徑。更近些的研究發(fā)現(xiàn)，能破壞網(wǎng)格蛋白和小窩介導的內吞的相關藥物及顯性負突變體不會影響輪狀病毒感染宿主細胞，而細胞所表達的一種動力蛋白的顯性負突變體——即一種GTPase(在一些膜分離過程中有一定作用)不會被病毒所影響。這些結果加上所觀察到的膽固醇的消耗會抑制RV感染表明，為了進入細胞，RV可能會用一種新確定的被描述為脂筏依賴的內吞作用的細胞內化途徑，這種內吞途徑為非網(wǎng)格蛋白和小窩依賴的，它依賴于動力蛋白和其對膽固醇損耗的敏感性。最近還報道，洛霉素A，一種液泡質子ATP酶泵的抑制劑，能夠阻斷RV感染?；谶@一發(fā)現(xiàn)，猜測可能存在一種內吞機制與RV的侵入有關[3]。

2.2.1 網(wǎng)格蛋白依賴的內吞途徑

受體介導的內吞作用是目前公認的生物體攝取生物大分子的途徑，而網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑是最主要的受體介導途徑。對TFR-41，Wa，UK和RRV株RV的研究顯示，用高滲溶液處理細胞從而阻礙網(wǎng)格蛋白網(wǎng)的形成，并且使網(wǎng)格蛋白重鏈無法表達，會減少除RRV株RV的其他三種毒株的感染力，這表明這三種毒株是通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑侵入細胞的。經蔗糖或NH4Cl(可破壞細胞的網(wǎng)格蛋白)處理的Caco-2和MA104細胞中，UK株RV顆粒數(shù)量明顯減少，而RRV株RV顆粒數(shù)量無明顯變化，這表明UK株RV的侵入依賴于網(wǎng)格蛋白和內體的酸化，而RRV株RV的侵入不依賴于網(wǎng)格蛋白和內體的酸化[2-4]。

2.2.2 非網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白依賴性內吞途徑

目前對RRV株RV侵入細胞機制研究較多，其是一種對經神經氨酸酶(NA)處理的細胞敏感的毒株，通過整合素α2β1、α5β3和熱休克蛋白hsc70作為受體，通過非網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白介導的依賴于功能性動力蛋白和細胞表面出現(xiàn)的膽固醇途徑侵入細胞。脂筏是一種在質膜中形成橫向裝配的富含鞘糖脂和膽固醇的膜微結構域，它被認為能夠作為頂端細胞蛋白質排列和信號轉導的特異性平臺，而且同樣也富含磷脂酰肌醇(GPI)連接蛋白和其他的信號蛋白和受體，是細胞進行多種生命活動的活躍區(qū)域，參與跨膜運輸分選、跨膜信號轉導和細胞骨架重建等過程。一些有囊膜病毒和無囊膜病毒通過脂筏侵入宿主細胞的報道也在不斷增多。

研究發(fā)現(xiàn)，藥物和顯性負性變體影響網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導的內吞，但不影響RV感染細胞。膽固醇的下降也可以抑制RV的感染，結合這些結果表明，RV的侵入必須應用新定義的內化途徑——即脂筏依賴的內吞。它不依賴于網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白，但依賴于膽固醇，并且對膽固醇的減少較敏感，細胞膜膽固醇的消耗會大大削弱RV的感染。如前文提到，RV吸附細胞似乎依賴于神經節(jié)苷脂。有研究顯示，耐NA和NA敏感性RV的感染力都被神經鞘糖脂生物合成抑制劑(PDMP)部分阻斷，而不被細胞O-鞘糖脂的抑制所影響。此外，從含β-甲基環(huán)化糊精的細胞膜中提出的膽固醇會將RV的感染力減少超過90%，而不會影響它們結合到細胞上?；谶@些研究表明，脂筏可能與RV侵入細胞有關。更近些的報道顯示，神經節(jié)苷脂GM1、整合素亞單位α2和β3及hsc70都與MA104細胞中的脂筏有關，而且發(fā)現(xiàn)感染性病毒粒子與細胞感染早期的這些微結構域有關[5]?？傊?，這些觀察結果表明，脂筏可能在RV的細胞侵入中起重要作用，其在此過程中充當組織腳手架，從而促進病毒粒子與細胞受體間的有效相互作用。

3 結語

RV侵入宿主細胞是一個復雜的過程，涉及一些細胞表面受體和一些外層病毒蛋白的區(qū)域。至少有一些細胞受體與蛋白質間的相互作用以順序的方式發(fā)生，它們似乎發(fā)生在鞘糖脂豐富的脂質微區(qū)域。所需要的一些細胞分子可能解釋這些病毒的細胞和組織趨向性。盡管已鑒定出許多細胞分子與早期的病毒與細胞表面的相互作用有關，但仍需確定的是哪種受體在病毒侵入、病毒蛋白與這些受體的相互作用引起的構象改變中和病毒內化的機制中起作用。RV侵入宿主細胞機制較為復雜，可能涉及多種不同的侵入方式。不同毒株的RV侵入細胞以不同的途徑，同種毒株RV侵入不同細胞的途徑也可能不同，同種RV株的野生型與經細胞培養(yǎng)多代的適應型的侵入途徑也可能有所不同。確定RV自然感染成熟腸上皮細胞所用的受體和侵入途徑的工作尤為重要。

[1] 聞曉波，冉旭華，宋佰芬. 輪狀病毒[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2013.

[2] Lopez S, Arias CF. Early steps in rotavirus cell entry.Springer-Verlag Berlin Heideberg[J]. CTMI，2006，309：39-66.

[3] Gutiérrez M, Isa P, Sánchez-San Martin C,etal.Different rotavirus strains enter MA104 cells through different endocytic pathways: the role of clathrin-mediated endocytosis[J]. J Virol，2010，84(18)：9161-9169.

[4] Sanchez-San Martin C, Lopez T, Arias CF, et al. Characterization of rotavirus cell entry[J]. Journal of virology，2004，78(5)： 2310-2318.

[5] Ewers H, Helenius A. Lipid-Mediated Endocytosis[J]. Cold Spring HarbPerspectBiol，2011 ，3(8)：a004721.