大鼠結(jié)腸原代成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

閻 慧，婁石磊，苗永迪，豈 蕊，郭子碩，邱 悅，孫 聰

(長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，吉林 長春 130117)

近年來，器官纖維化已經(jīng)成為世界醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)課題之一。其中結(jié)腸纖維化是克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和輻射性腸炎等多種慢性腸病較嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。成纖維細(xì)胞作為腸纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，增殖過度時(shí)分泌大量以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和細(xì)胞因子，是腸纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[2-3]。隨著腸纖維化研究的不斷深入，成纖維細(xì)胞的功能及相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)。安彩萍等[4]發(fā)現(xiàn)：隔藥灸可下調(diào)克羅恩病腸纖維化大鼠成纖維細(xì)胞中結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF) 和纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達(dá)。惠毅等[5]發(fā)現(xiàn)：烏梅丸可通過抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過度凋亡治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，其機(jī)制與抑制Bcl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)。目前對(duì)結(jié)腸成纖維細(xì)胞的研究較少，但腸道慢性疾病導(dǎo)致結(jié)腸纖維化已經(jīng)被證實(shí)。本課題組擬從體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞入手，通過改進(jìn)傳統(tǒng)的組織塊貼壁法，采用胰酶聯(lián)合差速貼壁培養(yǎng)法結(jié)合組織胚胎學(xué)、形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)法探討結(jié)腸成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)技術(shù)，為中藥有效成分干預(yù)腸纖維化疾病的體外研究提供細(xì)胞模型，為研究腸道慢性疾病的發(fā)病機(jī)制和臨床治療奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器健康成年Wistar雄性大鼠(封閉群)，體質(zhì)量約200 g，SPF級(jí)，購自吉林省長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2011-0004。大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌A7R5細(xì)胞，由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。高糖DMED干粉(美國Gibco公司)，胎牛血清(上海依科賽生物公司)，胰蛋白酶(1∶250)(美國GenView公司)，Anti-α-SMA、Anti-S100A4、Anti-E-cadherin和Anti-Vimentin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，超敏型HRP免疫組織化學(xué)試劑盒(上海生物工程股份有限公司)。Nikon Eclipse TS100熒光倒置顯微成像系統(tǒng)(日本尼康儀器有限公司)，Thermo 3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，TOMY ES-315高壓滅菌鍋(日本TOMY KOGYO公司)。

1.2 大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞培養(yǎng)和分離成年Wistar雄性大鼠，禁食不禁水48 h，腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL·kg-1。麻醉后浸泡入75%乙醇中進(jìn)行外部消毒，轉(zhuǎn)至無菌操作間迅速打開腹腔截取大鼠結(jié)腸，放入含1×105U·L-1青霉素和1×105U·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，反復(fù)沖洗結(jié)腸內(nèi)殘余糞便?？v向切開結(jié)腸，剔除腸系膜和脂肪組織，用眼科鑷子仔細(xì)刮去漿膜層和肌層。移入超凈工作臺(tái)用PBS洗滌，用眼科剪子將黏膜層和黏膜下層組織剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，均勻鋪布在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，組織間距0.5 cm。小心加入2 mL含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和1×105U·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸入培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)。3 d后換液，8～12 d后組織塊邊緣有大量細(xì)胞爬出。待細(xì)胞長滿瓶底，采用0.25%胰蛋白酶消化，再進(jìn)行反復(fù)貼壁去除貼壁速度較慢的其他細(xì)胞，分離得到成纖維細(xì)胞[6-7]。采用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。

1.3 大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞HE染色取對(duì)數(shù)期成纖維細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液，接種到細(xì)胞爬片上。待細(xì)胞接近長滿后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，95%乙醇固定15 min。取出細(xì)胞爬片PBS洗滌2次，經(jīng)蘇木素染色、稀鹽酸酒精分色、淡氨水藍(lán)化細(xì)胞核和伊紅染色，梯度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明處理3次，固定于載玻片上顯微鏡下觀察。

1.4 大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定分別取對(duì)數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞和大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌A7R5細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，充分吹打成單細(xì)胞懸液，接種到細(xì)胞爬片上。待細(xì)胞接近長滿后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min。取出細(xì)胞爬片PBS洗滌2次，加入0.5%Triton X-100 20 min，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育15 min，封閉液室溫封閉45 min。分別加入Anti-α-SMA、Anti-S100A4、Anti-E-cadherin和Anti-Vimentin 4℃過夜，次日室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，加入二抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，DAB室溫顯色30 min。固定于載玻片上顯微鏡下觀察波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、S100鈣結(jié)合蛋白A4(S100A4)和E鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 熒光倒置顯微鏡下大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)熒光倒置顯微鏡下觀察：結(jié)腸黏膜組織塊貼壁培養(yǎng)8 d時(shí)成纖維細(xì)胞開始從組織塊邊緣爬出；生長到12 d時(shí)成纖維細(xì)胞增殖速度逐漸加快，細(xì)胞呈扁平多突的紡錘形或星形；生長到15～20 d時(shí)細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到80%融合狀態(tài)(圖1，見插頁四)。

2.2 大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞HE染色結(jié)果顯微鏡下觀察：大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞體積大且突起較多，細(xì)胞質(zhì)被酸性染料伊紅染成粉紅色，細(xì)胞核被堿性的蘇木精染成藍(lán)紫色，且細(xì)胞核較大，呈卵圓形，著色較淺，核仁著色較深很明顯(圖2，見插頁四)。

2.3 大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞免組織化學(xué)鑒定免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞呈扁平多突的紡錘形或星形，細(xì)胞規(guī)則、大小一致；大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌A7R5細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞核呈卵圓形；結(jié)腸成纖維細(xì)胞中Vimentin蛋白呈陽性表達(dá)，α-SMA、E-cadherin和S100A4蛋白呈陰性表達(dá)；大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌A7R5細(xì)胞中Vimentin、α-SMA和E-cadherin蛋白呈陽性表達(dá)，S100A4蛋白呈陰性表達(dá)(圖3，見插頁四)。

3 討 論

腸纖維化是由于成纖維細(xì)胞異常增殖、ECM過度沉積導(dǎo)致，受多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路調(diào)控。目前國內(nèi)外多在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行研究，鮮有體外相關(guān)研究和報(bào)道。結(jié)腸位于消化道的末端，含有400多種細(xì)菌，構(gòu)成復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞時(shí)為避免污染，截取組織后應(yīng)立即放到含有青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基中沖洗。結(jié)腸由內(nèi)向外分為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層。黏膜層分為上皮層、固有層和黏膜肌層[8]，成纖維細(xì)胞定位于結(jié)腸黏膜固有層[9]，需認(rèn)真剝離其他組織才能獲得成纖維細(xì)胞。

本研究結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)結(jié)腸成纖維細(xì)胞初期生長緩慢，第8天細(xì)胞開始游出組織塊，第12天在顯微鏡下可觀察到組織塊周圍有大量細(xì)胞，15～20 d時(shí)已達(dá)到80%～90%融合狀態(tài)，鏡下觀察細(xì)胞生長呈旋渦狀或放射狀。雖然黏膜層也含有上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，但成纖維細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)，故采用時(shí)間差胰酶消化法和反復(fù)貼壁法進(jìn)行結(jié)腸成纖維細(xì)胞的分離[10]。本研究結(jié)果顯示：結(jié)腸成纖維細(xì)胞對(duì)于0.25%胰蛋白酶的敏感度較弱，加入胰蛋白酶消化后，成纖維細(xì)胞收縮變圓過程較慢，需要1.5～2.0 min才能消化完全。

本研究分別檢測(cè)細(xì)胞中S100A4、Vimentin、α-SMA和E-cadherin的表達(dá)，并用大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照來鑒定細(xì)胞種類。S100A4又稱成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein1，F(xiàn)SP-1)，是酸性的鈣結(jié)合蛋白家族的成員，具有調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲和增生的功能，與細(xì)胞分化、凋亡和基質(zhì)降解有關(guān)[11-12]。但本研究結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中S100A4蛋白表達(dá)均呈陰性，故進(jìn)一步采用Vimentin來鑒定細(xì)胞。Vimentin為Ⅲ型中間絲蛋白，主要表達(dá)于中胚層起源的間充質(zhì)細(xì)胞中，在成纖維細(xì)胞中大量分布，可作為成纖維細(xì)胞的標(biāo)記[13-14]。本研究結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)的細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)陽性，但平滑肌細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)也呈陽性，雖初步鑒定成纖維細(xì)胞但卻無法與平滑肌細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。α-SMA是細(xì)胞骨架的主要成分，是相對(duì)局限在平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的少數(shù)基因之一，是公認(rèn)的平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志物[15-16]。本研究結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中α-SMA蛋白不表達(dá)，而大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)，說明培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中不含有平滑肌細(xì)胞?？紤]成纖維細(xì)胞中還可能混有上皮細(xì)胞，故采用E-cadherin蛋白來區(qū)分，E-cadherin是鈣黏蛋白家族中的一員，主要位于上皮組織中，是一種Ca2+依賴的、同親型結(jié)合的細(xì)胞黏著糖蛋白，對(duì)胚胎發(fā)育的細(xì)胞識(shí)別、遷移、組織分化和組織器官構(gòu)成具有重要作用[17-18]。E-cadherin可作為上皮來源細(xì)胞標(biāo)志物，用來區(qū)別成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)陰性，說明培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中無上皮細(xì)胞。

雖然文獻(xiàn)中報(bào)道S100A4是成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，但本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞中S100A4表達(dá)呈陰性，考慮可能與種屬和來源有關(guān)，也有文獻(xiàn)[19]表明結(jié)腸腺癌細(xì)胞表達(dá)S100A4而正常結(jié)腸組織成纖維細(xì)胞不表達(dá)S100A4。

本研究采用胰酶聯(lián)合差速組織塊貼壁培養(yǎng)法這一原代培養(yǎng)技術(shù)成功培養(yǎng)出大鼠結(jié)腸成纖維細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞傳代驗(yàn)證，該細(xì)胞在15代內(nèi)均表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞的特性，超過15代后增殖速度下降。本研究中的培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便易行，細(xì)胞純度高，增殖速度快，為研究腸纖維化疾病的作用機(jī)制、臨床治療奠定了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。