血凝抑制試驗中常見問題的分析

楊建珍 ，康冬柳 ，胡愛明 ，劉建林 ，鄒盼 ，謝美靜 ，夏璇 ，肖鑫

（1.新干縣畜牧獸醫(yī)局，江西吉安331300；2.吉安市畜牧獸醫(yī)局；3.青原區(qū)畜牧獸醫(yī)局；4.吉安縣梅塘畜牧獸醫(yī)站；5.泰和縣畜牧獸醫(yī)局；6.青原區(qū)富田畜牧獸醫(yī)站；7.青原區(qū)天玉畜牧獸醫(yī)站）

血凝抑制試驗（HI）是基層獸醫(yī)實驗室常用的檢測禽流感及新城疫抗體效價的試驗方法，步驟簡單，但在操作中由于一些細(xì)節(jié)把控不到位，經(jīng)常出現(xiàn)試驗失敗或結(jié)果判定不準(zhǔn)確的問題。筆者就血凝抑制試驗中常出現(xiàn)的問題總結(jié)如下。

1 基本操作步驟

血凝抑制試驗（HI）常分為三個階段來完成，一是準(zhǔn)備階段，主要是準(zhǔn)備PBS液、阿氏液及1%雞紅細(xì)胞懸液；二是血凝試驗（HA）階段，主要是配制4單位抗原；三是血凝抑制試驗（HI）階段，主要是測定樣本的抗體效價。

2 各階段常出現(xiàn)的問題

2.1 準(zhǔn)備階段

準(zhǔn)備階段易出現(xiàn)的問題集中在反應(yīng)板的選擇、阿氏液的配制、公雞的來源、血細(xì)胞的洗滌、配制等方面。

2.1.1V型微量反應(yīng)板。由于基層實驗室試驗中多采用一次性反應(yīng)板來完成試驗，省去了洗滌重復(fù)利用的麻煩，在V型板的選擇中經(jīng)常不注意底部的角度要求為90°，而選用110°的反應(yīng)板；有些板由于擠壓等原因，角度已變形不符合實驗要求，造成在4單位抗原的判定及血凝抑制的結(jié)果判定中出現(xiàn)偏差。

2.1.2PBS液及阿氏液的配制。常見的問題是未進(jìn)行pH值調(diào)定。為省事，多數(shù)地方PBS液采用生理鹽水代替，阿氏液采用醫(yī)用抗凝采血管代替，但常見的問題是人用采血管中抗凝劑量過少，在公雞采血中易出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，造成紅細(xì)胞懸液的配制中紅細(xì)胞質(zhì)量不高。

2.1.31%雞紅細(xì)胞懸液的配制。最易出現(xiàn)的問題是紅細(xì)胞的洗滌中白細(xì)胞、血小板等吸取不徹底，或多管紅細(xì)胞集中為一管后，進(jìn)行洗滌的時間及次數(shù)過少，洗滌離心后上清液還未呈清亮、仍有紅黃色時就進(jìn)行配制了。另外供采血公雞的免疫狀況不清，有可能免疫過禽流感或新城疫等疫苗；或者配好的紅細(xì)胞懸液放置時間過長出現(xiàn)變質(zhì)、溶血等，均可造成紅細(xì)胞懸液失效。

2.2 血凝試驗（HA）階段

血凝試驗中常見的問題有：①反應(yīng)板選擇不當(dāng)，未選取90°的反應(yīng)板來完成試驗；②倍比稀釋中吸液不一致造成稀釋倍數(shù)偏差；③樣品稀釋中未每個樣品更換一個吸頭；④倍比稀釋后未每孔再加一次PBS液（或生理鹽水）；⑤加入紅細(xì)胞時未隨時振搖，加入紅細(xì)胞后未進(jìn)行消泡和振勻操作；⑥反應(yīng)時間及反應(yīng)溫度未按操作控制，特別易出現(xiàn)反應(yīng)溫度低而過早判定結(jié)果的現(xiàn)象；⑦結(jié)果判斷中未傾斜，或?qū)Τ恋砑澳陌盐詹坏轿?；⑧配制?u抗原或紅細(xì)胞放置時間長，出現(xiàn)失效、變質(zhì)。

2.3 血凝抑制試驗（HI）階段

血凝抑制試驗階段與HA階段試驗步驟基本一致，常見的問題也基本類似，除④中在倍比稀釋完成后加入的是4u抗原，需要在室溫下反應(yīng)30min左右外，有時也可能出現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)時間不夠的問題。

2.4 其它問題

另外還有幾個常見的問題：①沒有設(shè)定陰、陽性對照組；②記錄不規(guī)范。相關(guān)的編號、結(jié)果、試劑名稱和批號、樣品的來源及時間等內(nèi)容記錄不清，甚至有些結(jié)果都未記錄檢測的項目，造成H5、H7、新城疫等混淆。

3 解決方案

血凝抑制試驗是基層獸醫(yī)實驗室常做的試驗，為避免試驗結(jié)果的偏差，確保試驗順利完成，首先必須加強(qiáng)獸醫(yī)實驗室人員的培訓(xùn)，不僅要教會基本操作，還特別要從易出現(xiàn)問題的環(huán)節(jié)及細(xì)節(jié)處進(jìn)行把控，盡量按規(guī)范操作；其次獸醫(yī)實驗室操作人員要有細(xì)心、有耐心、有上進(jìn)心，嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)問題及時糾正，找出問題的原因，防止下次再犯；再次是要加強(qiáng)基層實驗室建設(shè)和保障，確保有開展試驗的必備條件和設(shè)備，如空調(diào)、恒溫箱、振蕩器、精準(zhǔn)的移液器、吸頭等；同時要保障實驗室人員的應(yīng)有待遇，讓獸醫(yī)實驗室人員沉得下、呆得住、專心做。