蛤蚧肽藥理活性及其分子鑒定技術(shù)研究

張 宇，林 賀，金 平，王 會，張 輝*，孫佳明*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春 130118）

蛤蚧（gekko gecko linnaeus），又名仙蟾、大壁虎等。屬于脊索動物門Vertebrata，爬行綱Reptilia，有鱗目Squamata，守宮科Geckonidae動物蛤蚧Gekko gecko除去內(nèi)臟的干燥體，主要產(chǎn)于廣西、云南、貴州等省區(qū)[1]。蛤蚧除了作為傳統(tǒng)中藥有藥用價值外，還具有保健食品功能，功效為補(bǔ)腎益肺、納氣定喘、助陽益精[2]。目前對蛤蚧成分研究主要集中在活性成分如功能蛋白質(zhì)、性激素樣化合物、脂類等。蛤蚧蛋白能夠調(diào)節(jié)腫瘤及化療藥物所造成的免疫功能抑制的作用[3]。目前市場上蛤蚧用量不斷擴(kuò)增，中藥來源逐年縮減，偽混品常參在蛤蚧藥材中，現(xiàn)已出現(xiàn)蛤蚧偽品多達(dá)18種[4]。因此本文總結(jié)了從DNA分子水平對傳統(tǒng)中藥蛤蚧及其偽混品的鑒定研究進(jìn)展，為蛤蚧的蛋白組分研究以及藥材的準(zhǔn)確鑒定提供參考。

1　分子水平鑒定

1.1細(xì)胞色素C氧化酶I亞基基因（COI）條形碼序列 DNA條形碼鑒別技術(shù)，能夠達(dá)到在利用不同個體所含不同DNA來鑒別藥材的真?zhèn)味萚5]。張紅印[6]構(gòu)建COI序列對比以及鄰接（NJ）樹。通過鑒定蛤蚧藥材和混偽品壁虎等共11個物種，103份樣品，所構(gòu)建的NJ樹中真品單獨聚在一支，能夠準(zhǔn)確與其混偽品區(qū)分。壁虎和蛤蚧雖為同科屬動物，但二者的性狀有很大差別，功效也不相同[7]。包華音等[7]通過應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)鑒別壁虎和蛤蚧，提取水溶性蛋白質(zhì)，對其進(jìn)行等體積PAGE，分析電泳圖譜。結(jié)果壁虎和蛤蚧的蛋白質(zhì)條帶在分布和數(shù)量方面存在比較明顯的差異。而且黑蛤蚧和紅蛤蚧，由于地理分布原因?qū)е聝煞N蛤蚧親緣性較遠(yuǎn)，應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)，對其進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示遺傳變異比較豐富，區(qū)域性很明顯[8]。

1.2COI序列的擴(kuò)增 在現(xiàn)代研究中利用COI序列鑒定蛤蚧時間稍長，蔣超等[4]建立一種快速PCR鑒別技術(shù)，在得到特異性條帶基礎(chǔ)上加入SYBR Green I染料后，365 nm紫外光照射有強(qiáng)烈綠色熒光，偽混品沒有以上兩種特征。該操作可快速鑒定，且在30 min內(nèi)就能完成。更有研究表明以線粒體 Cytb、COI、12S rRNA、16SrRNA 基因序列為基礎(chǔ)，顧海豐等[9]創(chuàng)建新方法，根據(jù)16條COI序列設(shè)計了1對位點特異性引物COISF、COISR，同時從Gen-Bank上下載 30 條序列，設(shè)計了Cytb SF、Cytb SR，16SrRNASF、16Sr RNASR，12SrRNASF、12SrRNASR這3對位點特異性引物，結(jié)果表明正品條帶出現(xiàn)擴(kuò)增，偽品條帶不擴(kuò)增。

1.3rRNA基因序列 張月云等[10]研究蛤蚧的兩個類群，黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的種群遺傳變異情況。采用了這兩個類群的6個個體線粒體的12S rRNA基因片斷序列，經(jīng)過系統(tǒng)學(xué)分析后，蛤蚧的2個類群間變異范圍是4.81%～6.73%；偽品壁虎與蛤蚧群間變異指數(shù)是30.44%～35.69%。經(jīng)此研究得到，黑斑蛤蚧和紅斑蛤蚧的暫且不能作為蛤蚧的兩個亞種。

2　蛋白組分

2.1蛤蚧的蛋白質(zhì)、肽、氨基酸 目前，國內(nèi)外研究中藥蛤蚧十分火熱，蛤蚧的活性成分主要有3種，醇溶性物質(zhì)，水溶性物質(zhì)，脂溶性物質(zhì)。醇溶性部分包括脯、谷、丙、精、天門冬、絲、賴等18種氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酸含量最高；水溶性部分包括鈣、磷等無機(jī)元素；脂溶性部分包括磷脂、糖脂等脂類。經(jīng)提取分離得到的蛋白質(zhì)、肽和氨基酸類，不僅在疾病治療以及預(yù)防方面有重要作用，而且在保健功能上也有突破。且蛤蚧醇提取物有良好的抗感染、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、保護(hù)肝功能作用明顯。在保健方面也有增強(qiáng)免疫，強(qiáng)身健體，延緩衰老等作用。蛤蚧中人體必需氨基酸含量豐富，占總量的30%～45%。龔千鋒等[11]對蛤蚧身體各部進(jìn)行氨基酸含量的分析結(jié)果表明：其體部和尾部所含氨基酸的加和量最高，分別為 570.18 mg/g 和 566.04 mg/g；頭部所含氨基酸的加和量低于體部、尾部，排第三；爪部所含氨基酸的加和量排第四；眼部所含氨基酸加和量為最低。但組氨酸、色氨酸含量低于各部位均值[12]。蛤蚧尾部氨基酸含量高于軀干部，其中作為機(jī)體的第一限制性氨基酸，賴氨酸的含量高138倍[12-13]。另還分離出一種多肽，具有抗感染活性。

2.2蛤蚧肽的藥理活性

2.2.1抗感染、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝 非酒精性脂肪肝（NAFLD）是一種以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的病理綜合征，當(dāng)前中藥蛤蚧在NAFLD疾病方面研究火熱。潘磊等[14]以高脂飼料法復(fù)制NAFLD小鼠模型，以灌服復(fù)方蛋氨酸膽堿溶液為對照藥，蛤蚧組小鼠各亞組分別灌服高中低劑量蛤蚧肽溶液。以8周為觀察期，記錄各組小鼠干預(yù)前后脂代謝、肝功能及炎性因子指標(biāo)變化差異。各組小鼠MDA水平均同干預(yù)前對比無統(tǒng)計學(xué)意義；除空白對照組及模型組小鼠各檢驗指標(biāo)較干預(yù)前無明顯變化外，其余組小鼠TG、TC等脂代謝指標(biāo)，ALT、AST等肝功能指標(biāo)及IL-6、TNF-α等炎性因子指標(biāo)均較干預(yù)前顯著降低，SOD水平則顯著提升；低劑量組各指標(biāo)變化幅度均小于中、高劑量組和陽性對照組小鼠；中、高劑量組和陽性對照組小鼠組間對比無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2免疫調(diào)節(jié) 哮喘嚴(yán)重威脅人類健康，發(fā)病率幾十年來一直呈上升趨勢。目前普遍認(rèn)為免疫失調(diào)是引發(fā)該病的重要原因。蛤蚧能明顯延長豚鼠的引喘潛伏期，顯著抑制哮喘反應(yīng)，表明蛤蚧具有良好的平喘作用[15]。班建東等[16]以卵清蛋白致敏方法建立BALB/c小鼠過敏性哮喘模型，給予黑斑蛤蚧粉干預(yù)治療。以肺組織病理變化，百分比以及IgE水平為指標(biāo)。結(jié)果肺組織炎癥改變不明顯；嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)百分比以及IgE水平顯著低于實驗對照（P＜0.05）。廖成成等[17]以酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血清中IL-4、IL-5、IFN-γ水平為指標(biāo)，黑斑蛤蚧能下調(diào)小鼠血清中的IL-4、IL-5水平（P＜0.05） ，同時上調(diào) IFN-γ水平（P＜0.05）。作用機(jī)制可能是黑斑蛤蚧通過雙向調(diào)節(jié) Th1 /Th2 失衡，從而抑制哮喘氣道炎癥。

中藥蛤蚧具有抗腫瘤作用，其機(jī)制也是眾多專家的研究熱點。李蕾等[13]提取并分離出不同分子量的蛤蚧蛋白組分，采用MTS法觀察到分離出的3種蛤蚧蛋白組分都具有不同程度地抑制HepG-2細(xì)胞生長的作用，其中分子量為3～20 kD的蛤蚧蛋白組分抑制作用最強(qiáng)，且具有劑量依賴性。Hoechst 33342 /PI雙熒光染色法檢測出3～20 kD蛤蚧蛋白作用后壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞均增加，RT-PCR法檢測出3～20 kD蛤蚧蛋白組分作用后c-myc基因mRNA表達(dá)水平稍降低，p53基因mRNA表達(dá)水平升高，但兩者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，Bax基因mRNA表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Bcl-2基因在蛋白作用前后均無表達(dá)。

2.2.3性激素樣作用 蛤蚧肽具有抗衰老作用。蔣興偉等[18]研究蛤蚧乙醇提取液對大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，使用TUNEL 和 PI、Annexin V / PI 3種方法檢測卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率，結(jié)果證實3月齡和6月齡實驗組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡均明顯少于對照組。說明蛤蚧乙醇提取液[19]能有效抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，從而改善大鼠卵巢功能，并可能由此延緩大鼠卵巢的衰老。

3　小結(jié)

蛤蚧作為傳統(tǒng)中藥，藥效好，臨床療效高。蛤蚧有效成分眾多，但是對于水溶性成分多肽以及蛋白質(zhì)類成分的藥理活性研究較少，以及蛤蚧肽的具體作用機(jī)制還有待研發(fā)。目前市場上的蛤蚧偽混品較難分辨，為達(dá)到快速鑒定的目的，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，在分子水平上進(jìn)行鑒定，為動物藥快速、現(xiàn)場鑒定提供了技術(shù)保障。