膿毒癥與相關(guān)生物分子關(guān)系的臨床研究進(jìn)展

張敏李倩

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院急診科,安徽蕪湖241001)

膿毒癥 (sepsis)的最新國際共識是指宿主對感染的失控反應(yīng),并引起嚴(yán)重危及生命的器官功能障礙[1-2]。在感染或可疑感染的基礎(chǔ)上對ICU和非ICU患者給出了不同的診斷標(biāo)準(zhǔn)。ICU患者序貫器官功能衰竭評分 (SOFA)≥2分,非ICU患者快速序貫器官功能衰竭評分 (qSOFA)符合2項及以上時即可診斷為膿毒癥[2]801-810。因其具有多病因、多影響因素、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜等特點,治療上一直沒有突破性的進(jìn)展。分子水平研究給膿毒癥的治療和預(yù)后評估帶來了新方向。本文重點綜述膿毒癥生物分子水平的最新研究成果。

1 膿毒癥與DNA

血漿游離DNA(cfDNA)是存在于血液、腦脊液等體液中片段化、具有較低分子量的DNA,由凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞釋放而來。正常情況下細(xì)胞凋亡釋放的cfDNA數(shù)小時內(nèi)會被清除,因此正常人cfDNA在較低水平維持動態(tài)平衡。因為cfDNA的半衰期較短,我們可以將測得的數(shù)值作為經(jīng)機(jī)體平衡后的實時含量。膿毒癥時,病原體入侵機(jī)體導(dǎo)致抗炎和促炎反應(yīng)的失衡,多種炎癥介質(zhì)的釋放相互作用形成網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)導(dǎo)致多系統(tǒng)多器官損傷。細(xì)胞被動裂解增多、cfDNA清除降低等使得cfDNA含量異常增高為其可能機(jī)制,且機(jī)體受損傷程度與其增高水平呈正相關(guān)。這不同于以往的監(jiān)測標(biāo)記物如PCT、CPR等。它們主要反應(yīng)促炎細(xì)胞因子水平、微生物產(chǎn)物水平[3],不能對膿毒癥患者做出準(zhǔn)確的預(yù)后評估。因此cfDNA水平的監(jiān)測可能成為診斷和評估膿毒癥的一個可靠指標(biāo)。由于膿毒癥沒有明顯的疾病前兆,而在膿毒癥發(fā)生的前6 h對患者采取積極的干預(yù)措施可以顯著降低患者病死率[4-5],因此這一監(jiān)測指標(biāo)尤為重要。銀雪等[6]人對31例全身炎癥反應(yīng)綜合征 (SIRS)和35例膿毒癥患者進(jìn)行cfDNA含量監(jiān)測,并以17例健康者cfDNA含量作為對照樣本。研究發(fā)現(xiàn)對照組和SIRS組cf-DNA顯著低于膿毒癥組,入院時的SOFA評分與第1天cfDNA濃度呈正相關(guān)。經(jīng)過進(jìn)一步分析后,他們認(rèn)為cfDNA的定量監(jiān)測可作為臨床治療效果和膿毒癥患者預(yù)后評估的指標(biāo)。若以cfDNA濃度＞8 939 GE/mL作為診斷膿毒癥的截斷值,其特異性和敏感性分別為80.65%和77.14%。目前,國內(nèi)外還沒有研究發(fā)現(xiàn)能對膿毒癥進(jìn)行早期識別的高敏感性的特異性監(jiān)測指標(biāo)。cfDNA對膿毒癥患者的臨床實用性和其預(yù)測價值仍有待進(jìn)一步的研究。

2 膿毒癥與RNA

2.1 微小RNAs(microRNA)

microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源基因編碼的小RNA,可通過多種方式參與調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá),約由22～27個核苷酸構(gòu)成。據(jù)推測,人類約1/3的基因表達(dá)受到miRNAs的調(diào)控[7]。當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體后,宿主細(xì)胞會產(chǎn)生大量miRNAs參與機(jī)體固有免疫應(yīng)答[8]。這為其治療提供了新思路。通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)比較健康對照組和早期膿毒癥組血漿中miRNAs的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)兩組間部分miRNAs存在明顯差異。這可能預(yù)示miRNAs會成為診斷膿毒癥的新近生物標(biāo)記物。研究發(fā)現(xiàn),多種信號通路如核因子κB(NF-κB)通路、Toll樣受體 (TLRs)信號途徑、JAK激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子 (JAK/STAT)通路等都參與了膿毒癥的病理過程。不同的JAK/STAT信號通路在膿毒癥的病理過程中介導(dǎo)不同的作用,其中JAK4/STAT6通路的激活可改善患者癥狀,降低病死率。miR-223可能通過調(diào)控START3通路從而調(diào)節(jié)IL-1β和IL-6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[9],在NF-κB通路中 miRNA-223參與對 IκB激酶 α(IKKα)的抑制從而減少了IL-12和IL-6的釋放,當(dāng)細(xì)菌LPS入侵宿主細(xì)胞時,miRNA-233下調(diào)促進(jìn)炎癥因子的釋放,參與早期促炎反應(yīng)。有研究表明,相對于PCT、CRP,miRNA-233對膿毒癥的預(yù)測靈敏度最高[10]。當(dāng)機(jī)體經(jīng)TLRs信號途徑識別病原體后,可介導(dǎo)miRNA-146a的表達(dá)調(diào)節(jié)急性炎癥反應(yīng)。適量釋放的促炎因子可促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集以清除細(xì)菌,miRNA-15a、miRNA-16的過度表達(dá)會抑制TLR4通路介導(dǎo)的促炎因子的釋放。有研究稱,與 CRP、PCT比較,miR-15a用于鑒別SIRS和膿毒癥具有更好的敏感性和特異性。

2.2 長鏈非編碼RNA(lncRNA)

多器官功能障礙是膿毒癥最新定義的重點指向。其中心功能障礙為膿毒癥患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,也是膿毒癥患者的主要死因之一。lncRNA是長度在200～100 000個核苷酸之間的非編碼RNA。以目前的研究成果,我們?nèi)孕杓訌?qiáng)對lncRNA的研討,臨床上在循環(huán)系統(tǒng)的運(yùn)用主要集中在尋找特異性的lncRNA生物標(biāo)記物和其作為潛在的藥物治療靶點。膿毒癥時促炎因子的分泌是心肌損傷的根本原因,有研究表明TNF-α是一種能夠引起心肌延展性和收縮峰值速率下降的促炎因子。lncRNA可通過間接調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α等從而調(diào)控心肌損傷。在對感染小鼠骨髓源性巨細(xì)胞的RNA研究中發(fā)現(xiàn)多種lncRNA表達(dá)水平增高,其中l(wèi)ncRNA-環(huán)氧化酶2(COX2)升高最明顯。lncRNA-COX2可通過調(diào)節(jié)TLR-NF-κB通道促進(jìn)炎癥發(fā)展。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn),其他lncRNA如linc0206、linc 3995、linc7190和linc7705均參與了調(diào)節(jié)TNF-α或 IL-6的水平但其機(jī)制未知。另一方面,Ca2+濃度的變化不僅直接影響心肌興奮收縮耦聯(lián)還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放。在一定水平內(nèi)的Ca2+濃度升高可以增加心肌收縮力,但若線粒體內(nèi)Ca2+超載則會導(dǎo)致不可逆的損害甚至細(xì)胞死亡。在對果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)[12],多種lncRNA通過肌質(zhì)網(wǎng)的ATP酶參與調(diào)節(jié)Ca2+濃度從而調(diào)控心肌功能。然而在膿毒癥中,lncRNA通過何種方式調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞尚需進(jìn)一步研究。

3 膿毒癥與基因編碼的蛋白質(zhì)

3.1 程序性死亡受體 (PD-1)

基因表達(dá)的完整性取決于轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的改變等一系列過程,蛋白質(zhì)是mRNA翻譯后的加工產(chǎn)物,那么對蛋白質(zhì)進(jìn)行人為的干預(yù)修飾會直接影響著基因的表達(dá)。隨著基因研究的不斷深入,人們逐漸意識到某些基因編碼的蛋白質(zhì)經(jīng)人為干預(yù)后可調(diào)節(jié)膿毒癥的炎癥反應(yīng)。有動物實驗表明,在膿毒癥早期階段免疫系統(tǒng)即受到抑制[13]。這對預(yù)防組織過度炎癥反應(yīng)極其重要。PD-1作為CD28超家族成員中一種重要的免疫抑制分子,可與B7家族中PD-L1結(jié)合。PD-L1主要表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞表面如樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等。當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞表面高表達(dá)PD-1時會出現(xiàn)免疫耐受,影響樹突狀細(xì)胞抗原呈遞能力,導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞吞噬能力降低等。有研究發(fā)現(xiàn),在膿毒癥患者外周血中發(fā)現(xiàn)一類PD-L1+抑制表型中性粒細(xì)胞亞型,可通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸方式抑制T細(xì)胞功能[14]。最新研究[15]認(rèn)為PD-1/PD-L1可導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭。PD-1與T細(xì)胞膜上PD-L1配體結(jié)合使T細(xì)胞呈無應(yīng)答狀態(tài)和 (或)凋亡。有研究認(rèn)為,中性粒細(xì)胞膜上高表達(dá)的PD-L1可以作為膿毒癥患者出現(xiàn)免疫抑制的更好的生物標(biāo)記物[16]。自然殺傷細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用,是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞能夠識別靶細(xì)胞、釋放殺傷介質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn),在感染單純皰疹病毒后,患者自然殺傷細(xì)胞膜上出現(xiàn)PD-1高表達(dá)現(xiàn)象,而PD-1+NK細(xì)胞抗感染、抗腫瘤能力均顯著降低[17]。因此有學(xué)者認(rèn)為PD-1/PD-L1可以決定膿毒癥患者免疫狀態(tài),是導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同結(jié)局的關(guān)鍵因素?；蛟S可以通過調(diào)節(jié)PD-1/PDL1的表達(dá)來調(diào)控機(jī)體免疫平衡以改善膿毒癥患者預(yù)后水平。

3.2 高遷移率族蛋白Bl(HMGBl)

現(xiàn)階段臨床醫(yī)師在對膿毒癥患者進(jìn)行治療時,主要的干預(yù)措施是早期的液體復(fù)蘇和控制感染,然而針對早期致炎因子如IL-1、TNF等的治療效果并不令人滿意。因為早期炎癥因子在炎癥反應(yīng)開始數(shù)小時后就恢復(fù)到基礎(chǔ)水平而炎癥的損害卻一直持續(xù)。作為細(xì)胞核內(nèi)非組蛋白的HMGB1是一種晚期促炎因子,具有3個獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域,分別為A-box、B-box和C-端。其中B-box是HMGB1發(fā)揮炎癥作用的功能區(qū),A-box是B-box的拮抗位點可作為潛在的 HMGB1的拮抗劑,C-端是調(diào)節(jié)HMGB1與 DNA相互作用的重要結(jié)構(gòu)[18]。同時HMGB1自身也可作為促炎因子,在膿毒癥病理過程中與TNF-α、IL-1、IL-8等炎性因子在炎性反應(yīng)通路上形成一個促炎的正反饋環(huán)路,通過破壞炎癥反應(yīng)中促炎細(xì)胞因子和抵抗炎癥的抗炎細(xì)胞因子之間的動態(tài)平衡導(dǎo)致炎癥級聯(lián)信號放大。對小鼠膿毒癥的實驗中發(fā)現(xiàn)其HMGB1含量增加明顯且不管小鼠對LPS是否敏感,將重組HMGB1經(jīng)腹腔注射到小鼠體內(nèi)后,小鼠均死亡。因此推測HMGB1可能是導(dǎo)致小鼠死亡的直接原因而并非LPS。大量臨床研究中發(fā)現(xiàn),膿毒癥病人的血清中HMGB1水平明顯高于正常人且其升高水平與APACHEⅡ評分、qSOFA評分對于膿毒癥患者評估的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。大多數(shù)膿毒癥患者住院7 d后其血清HMGB1濃度仍處于較高水平。在因膿毒癥死亡的患者中發(fā)現(xiàn)相對于其他炎癥因子如TNF、IL-8等血清HMGB1濃度高達(dá)數(shù)百倍,從而說明HMGB1水平與膿毒癥休克患者的病情進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)[19]。因此動態(tài)檢測HMGB1水平有助于對患者預(yù)后的評估和調(diào)整治療方案,同時也為膿毒癥的抗炎治療提供了一個更好的新靶向,具有重要的意義。

3.3 可溶性白細(xì)胞分化抗原14亞型 (sCD14-ST,即Presepsin)

CD14是存在于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的一種白細(xì)胞分化抗原,以膜結(jié)合 (mCD14)型和可溶性 (sCD14)兩種不同的形式存在于體內(nèi)。sCD14是一種由348個氨基酸構(gòu)成的糖蛋白,高達(dá)機(jī)體總CD14含量的99%。當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時,mCD14或sCD14被血漿中激活的組織蛋白酶裂解后產(chǎn)生一種相對分子質(zhì)量為13 000的片段即為sCD14-ST。Presepsin作為LPS結(jié)合蛋白的受體不僅可直接參與機(jī)體體液和細(xì)胞免疫反應(yīng),起到LPS信息呈遞作用來促進(jìn)單核細(xì)胞分泌TNF-α等各種細(xì)胞因子介導(dǎo)一系列免疫炎癥反應(yīng),更重要的是促進(jìn)LPS向脂蛋白轉(zhuǎn)移[20]并促進(jìn)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞吞噬脂多糖結(jié)合蛋白以清除細(xì)菌及內(nèi)毒素。目前,PCT在膿毒癥患者的治療和預(yù)后評估[21]中具有較高的應(yīng)用價值。有研究表明PCT在膿毒癥的診斷上的特異性和敏感性均高于Presepsin。Masson[22]等證明了Presepsin水平對膿毒癥患者的病情判斷及預(yù)后評估方面優(yōu)于PCT。然而Presepsin會受到如年齡、腎損傷等因素的影響,因此與其他生物分子聯(lián)合診斷可能是較好的解決方法[23]。以Presepsin作為診斷的截斷值設(shè)定還需要大樣本的研究提供依據(jù)。

4 結(jié)語與展望

在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中遺傳和環(huán)境是兩個重要的影響因素。臨床治療策略目前還沒有突破性進(jìn)展,主要原因是其病理過程涉及到復(fù)雜的全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、機(jī)體免疫功能和患者對病原體的易感性等多個方面且具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。對于膿毒癥生物分子水平的研究仍在繼續(xù),無論是在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平還是在翻譯水平都取得了一定的成果。盡管目前CRP、PCT等在臨床上已經(jīng)普遍應(yīng)用于對膿毒癥患者的評估并指導(dǎo)臨床醫(yī)師的決策,但膿毒癥的發(fā)生率和病死率并沒有得到明顯改善。尋找具有高特異性和高敏感性的生物分子以區(qū)分是否因感染引起的全身炎癥反應(yīng)相關(guān)的多器官功能障礙更具有挑戰(zhàn)性。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,更多免疫學(xué)、基因?qū)W方面新的特異性標(biāo)記物將被發(fā)現(xiàn),彌補(bǔ)了單純炎癥標(biāo)記物的不足,并將給臨床醫(yī)師一個更準(zhǔn)確的參考標(biāo)準(zhǔn)和更好的治療手段。但是就目前對于膿毒癥的研究成果來說,還需要大樣本隨機(jī)對照試驗來驗證以使其更具普遍性和科學(xué)性。這樣才能廣泛應(yīng)用于臨床為膿毒癥患者的診斷及預(yù)后提供更好的參考標(biāo)準(zhǔn)。