免疫性血小板減少癥患者 CD19+CD24highCD27+及CD24highCD27+CD38highB調(diào)節(jié)細(xì)胞的表達(dá)

費(fèi)菊萍，壽黎紅，董曉輝，曹丹，方遒，徐偉來(lái)，韋菊英，劉輝

B調(diào)節(jié)細(xì)胞（Breg）是一組誘導(dǎo)免疫耐受的免疫抑制細(xì)胞，其通過(guò)產(chǎn)生白介素10、白介素35、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b（TGF-b）等細(xì)胞因子抑制病理性T細(xì)胞及其他炎癥前淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，從而抑制病理性的免疫過(guò)程。不同的炎癥環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生不同的Breg細(xì)胞，目前人體中已鑒定出 CD24highCD27+[1]、CD19+CD24highCD27int[2]、CD19+CD24highCD38high[3]、CD19+CD25highCD71high[4-5]等多種Breg細(xì)胞，在感染、結(jié)締組織病等中具有重要作用。為了研究 Breg細(xì)胞在免疫性血小板減少癥（ITP）中的作用，筆者檢測(cè)了 CDl9+CD24highCD27+細(xì)胞及 CD24highCD27+CD38high細(xì)胞在ITP患者外周血中的數(shù)量，以探討B(tài)reg細(xì)胞在ITP中的作用。報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集2015年7月至2017年12月浙江省湖州市中心醫(yī)院和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的ITP患者80例，其中男33例，女47例；年齡16～80歲，中位年齡41歲。診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)按成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)（2016年版）[6]。對(duì)照組為45例本院同期健康志愿者。

1.2主要試劑 CD19 FITC、CD27 APC及CD24 PE單抗均購(gòu)自美國(guó)BD公司，CD38PE-CY7單抗購(gòu)自美國(guó)beckman coulter公司。

1.3方法 取外周血標(biāo)本 2 m l，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)表型為CD19+CD24highCD27+及 CD24highCD27+CD38high細(xì)胞。檢測(cè)步驟：（1）取適量CD19、CD24、CD27 和CD38單抗，加入上樣管中和100l外周血，輕輕振蕩混勻，孵育15min；（2）加入2m l氯化銨裂解液的工作液，振蕩均勻，作用 10min，1500 r/min 離心 5min，去上清；（3）加入100l磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸后上機(jī)檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用 檢驗(yàn)，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CD19+CD24highCD27+表型細(xì)胞及CD24highCD27+CD38high表型Breg細(xì)胞的測(cè)定 首先通過(guò)前向角散射（FSC）及側(cè)向角散射（SSC）兩個(gè)參數(shù)圈門標(biāo)記出淋巴細(xì)胞群，應(yīng)用 FSC參數(shù)和 CD19單抗標(biāo)記出CD19+B淋巴細(xì)胞，通過(guò)CD24單抗及CD27單抗從CD19+B淋巴細(xì)胞標(biāo)記出CD24highCD27+細(xì)胞，最后通過(guò) CD38單抗從 CD24highCD27+淋巴細(xì)胞標(biāo)記出CD24highCD27+CD38high細(xì)胞（封二彩圖 1）。

2.2CD19+CD24highCD27+Breg細(xì)胞在ITP患者的表達(dá) ITP患者的CD19+CD24highCD27+細(xì)胞占CD19+淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為（14.167 4±12.1）%，對(duì)照組為（33.053 8±10.3）%，ITP患者組低于正常對(duì)照組（=6.487=0.000）。見(jiàn)封二彩圖2。

2.3CD24highCD27+CD38highBreg細(xì)胞在ITP患者中的表達(dá) ITP患者的 CD24highCD27+CD38highBreg細(xì)胞占 CD19+細(xì)胞的中位數(shù)為 0.63%，均值為（1.28±1.56）%，而占CD19+CD24highCD27+細(xì)胞中位數(shù)6.725%，均數(shù)為（8.3775±8.02）%。

3　討論

Breg細(xì)胞又被稱為B10細(xì)胞，通過(guò)分泌白細(xì)胞介素10（IL-10）和腫瘤生長(zhǎng)因子-（TGF-）等細(xì)胞因子，抑制Th1、CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞、DC細(xì)胞、單核細(xì)胞及Th17等細(xì)胞或刺激Tr1、Foxp3+Treg細(xì)胞（抑制性T細(xì)胞）發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。大多數(shù)B10細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD24和CD27，新鮮外周血中IL-10+B10細(xì)胞主要存在于 CD24high或 CD27+B細(xì)胞亞群中，CD24highCD27+B細(xì)胞占外周血 B淋巴細(xì)胞25%左右。LPS+PIB刺激5h，CD24highCD27+亞群產(chǎn)生IL-10的能力是 CD24lowCD27－B細(xì)胞的10倍以上；而CD40L、LPS、LPS+CD40L、CpG 或 CpG+CD40L 刺激72h，CD24highCD27+B細(xì)胞分泌IL-10的能力亦顯著優(yōu)于CD24lowCD27－B細(xì)胞，說(shuō)明B10細(xì)胞及其前體細(xì)胞均存在于CD24highCD27+亞群中，屬于CD24highCD27+B細(xì)胞的一個(gè)亞群[7]，CD24highCD27+B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD24highCD27+CD38highBreg細(xì)胞需要細(xì)胞因子的刺激。本研究顯示，健康對(duì)照CD24highCD27+細(xì)胞占外周血CD19+B淋巴細(xì)胞的33%，CD24highCD27+CD38highBreg細(xì)胞僅占CD19+B淋巴細(xì)胞的1%左右，可能與檢測(cè)前未予CD40L、LPS或CpG等刺激有關(guān)。

Breg細(xì)胞功能缺陷或數(shù)量異常在自身免疫性疾病發(fā)生中具有重要作用。Blair等[1]研究證明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者的CD19+CD24highCD38high細(xì)胞與健康人相比，其產(chǎn)生IL-10的能力及抑制T細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力均受到損害，表明SLE患者Breg的功能有缺陷。Flores-Borja等[3]發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者CD19+CD24highCD38highB細(xì)胞不能將CD4+CD25－T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞或抑制T(H)17的發(fā)展，但卻保持了抑制T(H)1細(xì)胞分化的能力，活動(dòng)性RA患者外周血CD19+CD24highCD38highB細(xì)胞數(shù)量減少，是引起RA的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血CD19+CD24highCD27+細(xì)胞數(shù)顯著低于健康對(duì)照組，提示ITP患者可能存在Breg細(xì)胞數(shù)量異常。Li等[8]發(fā)現(xiàn)慢性ITP患者CD19+CD24highCD38highBreg細(xì)胞數(shù)量減少及其功能的下降，IL-10的表達(dá)及TNF-的抑制作用減弱。徐偉來(lái)等[9]發(fā)現(xiàn)新診斷ITP患者、持續(xù)或慢性ITP患者的CDl9+CD24highCD27+細(xì)胞均低于健康對(duì)照組，說(shuō)明Breg細(xì)胞異常是ITP發(fā)生的重要機(jī)制之一。

綜上所述，CD19+CD24highCD27+細(xì)胞與CD24highCD27+CD38high細(xì)胞是人外周血中重要的Breg細(xì)胞，ITP患者存在CD19+CD24highCD27+細(xì)胞數(shù)量減少與功能缺陷，與ITP的發(fā)生可能有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：