丙戊酸和氫氣對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷小膠質(zhì)細(xì)胞表型影響的研究進(jìn)展

馬野川，吳曦子，曾仁慶，崇巍

(1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科,遼寧 沈陽(yáng) 110000)

全球因中度和重度創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)致殘人數(shù)每年高達(dá)80 000人[1]，TBI對(duì)青年的高致死率給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)[2]。TBI治療指南指出，TBI的治療策略應(yīng)致力于改善腦缺氧、低灌注和腦水腫狀態(tài)[3]。然而現(xiàn)今臨床上對(duì)于此方面的治療手段仍然有限，因而積極尋找有效的治療TBI的方法十分必要。

1 TBI與炎癥反應(yīng)

TBI包括對(duì)顱腦的首次打擊和二次打擊。首次打擊為創(chuàng)傷瞬間機(jī)械力造成組織形變，直接損傷周圍血管、軸突、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，造成多發(fā)及彌漫性損傷。首次打擊因其損傷程度不同且人為可控性有限，以預(yù)防為主。二次打擊被視為首次打擊的并發(fā)癥，發(fā)生于首次打擊后的幾分鐘至數(shù)日[4]，其始動(dòng)因素是首次打擊造成的腦組織急性缺血、缺氧，可誘發(fā)腦細(xì)胞水腫，致使顱內(nèi)壓升高、灌注壓下降，進(jìn)一步加重缺氧缺血，同時(shí)誘發(fā)炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)和自由基的過(guò)度釋放，引起炎癥反應(yīng)、細(xì)胞膜通透性改變、血腦屏障開(kāi)放，破壞生理生化代謝和線粒體功能，進(jìn)一步加重腦細(xì)胞水腫，并誘導(dǎo)凋亡基因活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。

英國(guó)腦損傷治療指南指出，防治TBI后的二次打擊損傷是降低TBI病死率的主要策略，避免低氧和低灌注、控制炎癥反應(yīng)、減輕腦細(xì)胞水腫和降低顱內(nèi)壓是治療的重點(diǎn)。治療措施包括高質(zhì)量的高級(jí)創(chuàng)傷生命支持；維持氣道通暢、給予高通氣量、提供充分氧合、保證有效循環(huán)，靜脈給予高滲液、甘露醇和糖皮質(zhì)激素、鎮(zhèn)靜抗驚厥藥，骨瓣減壓等，以減輕腦細(xì)胞水腫滲出和炎癥反應(yīng)，降低顱內(nèi)壓，維持顱內(nèi)灌注，但上述治療手段在重型TBI國(guó)際治療指南中推薦等級(jí)均較低[3]276-278。事實(shí)上，在嚴(yán)重TBI早期，腦組織水腫合并灌注不足的情況下，常壓給氧難以達(dá)到充分氧合目的，且高壓氧的治療效果尚存在爭(zhēng)議[6]，因而，在有限的治療時(shí)間窗內(nèi)，阻斷低氧-炎癥-水腫-低灌注-低氧是TBI二次打擊的治療靶點(diǎn)，其根本在于有效抑制缺氧造成的炎癥反應(yīng)。

2 小膠質(zhì)細(xì)胞表型與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)

巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控者，受到外界刺激可分化為兩種功能表型：M1型(促炎型)和M2型(抑炎型)，并表達(dá)出相應(yīng)的表型標(biāo)志物，參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。M1型和M2型巨噬細(xì)胞可以共同存在，維持動(dòng)態(tài)平衡，二者的相互關(guān)系控制著促炎或抑炎方向的轉(zhuǎn)化，調(diào)控機(jī)體對(duì)外界刺激的清除和修復(fù)。兩種表型的轉(zhuǎn)化被細(xì)胞內(nèi)外一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄后修飾所調(diào)控[7]。中樞系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)調(diào)控者為小膠質(zhì)細(xì)胞，在早期胚胎形成過(guò)程中，單核細(xì)胞隨血液移動(dòng)到腦組織，分化成小膠質(zhì)細(xì)胞，因此，小膠質(zhì)細(xì)胞和骨髓及外周單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞擁有許多相同的表面標(biāo)記物和抗原[8]。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答和抗原呈遞，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和化學(xué)分子，調(diào)控炎癥反應(yīng)并介導(dǎo)免疫應(yīng)答，同時(shí)也參與生理狀態(tài)下中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育。與巨噬細(xì)胞相似，當(dāng)外界微環(huán)境變化時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞得以活化。與巨噬細(xì)胞相似，外界微環(huán)境變化可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分化出類似的功能表型：M1型和M2型。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子和細(xì)胞毒性介質(zhì)，引起神經(jīng)元功能障礙或細(xì)胞死亡；M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可吞噬清除細(xì)胞碎片，釋放神經(jīng)生長(zhǎng)因子和抗炎因子，抑制神經(jīng)損傷，促進(jìn)損傷部位修復(fù)[4]124-142。

在TBI發(fā)生的數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)，在TBI發(fā)生的數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)，固守在神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和聚集的多型核細(xì)胞開(kāi)始釋放細(xì)胞因子，與此同時(shí)，促炎性細(xì)胞因子的釋放反饋性誘導(dǎo)抗炎因子的合成，這種動(dòng)態(tài)的自身反饋調(diào)節(jié)維持著相對(duì)穩(wěn)定的免疫狀態(tài)[9]，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為M1型增加，當(dāng)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞將損傷細(xì)胞碎片清除后，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸增多，啟動(dòng)組織修復(fù)再生。然而，當(dāng)TBI過(guò)重時(shí)，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量不斷增加，促炎因子大量釋放，自身調(diào)節(jié)的免疫穩(wěn)態(tài)被打破，過(guò)度的炎癥反應(yīng)加重腦組織損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和神經(jīng)退行性變[10]。研究表明在TBI早期，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量與腦白質(zhì)損傷嚴(yán)重程度相關(guān)[11]。因此，TBI缺氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是一把雙刃劍，如何調(diào)控促炎和抑炎效應(yīng)，即缺氧狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞M1型和M2型的動(dòng)態(tài)平衡顯得尤為重要。準(zhǔn)確把握缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞表型變化規(guī)律，可成為T(mén)BI的治療靶點(diǎn)。

3 VPA與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)

組蛋白(histone)是染色體的重要組成部分，主要包括組蛋白H2A、H2B、H3、H4等。組蛋白的賴氨酸殘基可以被乙?；痆12]，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，可影響包括免疫反應(yīng)在內(nèi)的眾多細(xì)胞信號(hào)通路。組蛋白乙?；腿ヒ阴；謩e由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)調(diào)控，共同維持“乙?；€(wěn)態(tài)”。HAT使組蛋白乙?；M蛋白被松解，纏繞在組蛋白上的基因序列暴露出來(lái)，轉(zhuǎn)錄因子更易接近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)。反之，HDAC使染色體組蛋白去乙?；种苹蜣D(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)可以阻止HDAC的去乙?；m正組蛋白低乙?；?，暴露基因轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，上調(diào)轉(zhuǎn)錄，恢復(fù)“乙?；€(wěn)態(tài)”，從而抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞的生存[12]834-840。TBI發(fā)生時(shí)，染色體乙酰化穩(wěn)態(tài)被打破，腦細(xì)胞核內(nèi)的組蛋白(尤其是組蛋白H3)乙酰化水平降低，引起興奮性損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[4]124-142。在TBI引起脊髓損傷的大鼠模型中，HDACI可上調(diào)原代小膠質(zhì)細(xì)胞的GSK3-β表達(dá)，使PTEN磷酸化而失活，進(jìn)而增強(qiáng)PI3K-Akt信號(hào)通路使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化[12]2853-2858。

丙戊酸(valproic acid，VPA)VPA屬于廣譜HDACI，可抑制多種HDAC，臨床上用于抗癲癇和抗雙向情感障礙治療，研究表明其對(duì)顱腦缺血損傷、炎癥反應(yīng)和TBI等均有保護(hù)作用[13]。VPA可降低缺血等造成的炎癥反應(yīng)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，提高組蛋白H3乙?；?，增加熱休克蛋白70的表達(dá)和Akt磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化[12]2853-2858；另外，在膠質(zhì)細(xì)胞存在的環(huán)境中，VPA通過(guò)抑制腫瘤壞死因子-α的分泌和一氧化氮的生成，從而抑制炎癥反應(yīng)[13]162-169。在大動(dòng)物TBI合并失血性休克模型以及單純TBI模型中，VPA能夠保護(hù)腦神經(jīng)，減輕腦水腫和二次打擊損傷，并有助于TBI后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[14-16]。上述表明，VPA對(duì)維持TBI乙?；€(wěn)態(tài)有重要作用，極有可能通過(guò)影響小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而調(diào)控缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

4 H2與炎癥反應(yīng)

H2是一種常見(jiàn)的還原性氣體，2007年有關(guān)H2的研究表明動(dòng)物吸入2%的H2可特異性清除自由基-羥自由基(·OH)和過(guò)氧亞硝基陰離子(ONOO-)，顯著改善大鼠腦缺血再灌注損傷[17]，引起了廣泛關(guān)注。此后研究發(fā)現(xiàn)H2在多種細(xì)胞和器官中均具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。研究表明H2主要的作用機(jī)制為：(1)直接特異性清除由灌注不足、缺血再灌注和炎癥等產(chǎn)生的·OH和ONOO-，減輕二者對(duì)細(xì)胞的急性氧化損傷，進(jìn)而抑制氧自由基誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化產(chǎn)物，阻止脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞核DNA損傷[18]；(2)通過(guò)間接促進(jìn)NF-E2-related factor 2(Nrf2)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，增加血紅素加氧酶1(OH-1)等抗氧化酶表達(dá)，降低氧化損傷；(3)間接降低炎癥細(xì)胞因子，減少炎癥細(xì)胞富集，具有廣泛的抗炎功能，對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)、酵母聚糖引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，均具有治療作用[19]。H2可以通過(guò)吸入、靜脈注射或口服富氫鹽水等方式給予。吸入H2不影響正常生理狀態(tài)下的氧化還原反應(yīng)，且具有良好的生物膜透過(guò)性和組織彌散能力，可迅速到達(dá)病灶。研究證實(shí)吸入H2不影響腦缺血患者的各項(xiàng)生理指標(biāo)水平[18]289-317，且在心肌缺血早期未恢復(fù)血液供應(yīng)時(shí)仍可以到達(dá)壞死部位[4]124-142。目前研究顯示吸入H2對(duì)顱內(nèi)缺氧再灌注損傷和缺血/缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷均具神經(jīng)保護(hù)作用[18]289-317：給予腦梗死大鼠吸入2% H2可降低小膠質(zhì)細(xì)胞集結(jié)，達(dá)到抗炎效果[17]688-694；在手術(shù)致腦損傷模型中，吸入2.9% H260 min可有效減輕大鼠腦水腫[20]；給予缺氧孕鼠吸入2% H2可降低胎鼠顱腦損傷[21]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，H2可抑制巨噬細(xì)胞在百草枯刺激下的M1型炎癥因子產(chǎn)生。除可以促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)導(dǎo)外，H2也可降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者硝化酪氨酸水平，提示H2可能通過(guò)與ONOO-反應(yīng)，從而降低轉(zhuǎn)錄控制因子(-O-NO2、-S-NO2)水平，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[22]。其次，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)飲用富氫鹽水可上調(diào)胃饑餓素(Ghrelin)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，表現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用[23]。研究表明H2還可通過(guò)上調(diào)或下調(diào)某些凋亡相關(guān)基因發(fā)揮抗凋亡作用，例如刺激抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL 的表達(dá)，抑制促凋亡基因 casapase 3 、caspase 8和caspase 12 的表達(dá)[7]787-795。綜上，H2可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄控制因子(O-NO2、-S-NO2)或某些凋亡相關(guān)基因發(fā)揮發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。而小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化也伴隨著轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的改變，如M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌抗炎因子IL-10，抑制NF-κB同工型，其表型標(biāo)記物有Arg-1，CD206，Ym1，F(xiàn)izz1[24-25]。因此，H2可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子水平或下游炎癥因子的表達(dá)，從而調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型來(lái)抑制TBI缺氧損傷。

綜上，小膠質(zhì)細(xì)胞的表型變化過(guò)程在TBI炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色VPA和H2可抑制TBI的炎癥反應(yīng)，且該抑制作用很可能通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)，該思路為進(jìn)一步探索TBI治療策略提供理論基礎(chǔ)，仍需進(jìn)一步體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探究和驗(yàn)證。