結(jié)直腸癌診斷指標(biāo)的研究進(jìn)展

楊 靜， 朱林敏， 陳興國

（天津市泰達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300457）

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤的10%，其在惡性腫瘤中居第3位[1]，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在我國，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率日漸增加，死亡率亦大幅增加，尤其在近十年，結(jié)直腸癌發(fā)病率的增加每年＞4%，遠(yuǎn)超2%的國際水平[2]。早期的結(jié)直腸癌預(yù)后和生存質(zhì)量較好，但常因無臨床癥狀而被忽視，延誤了診治，一旦出現(xiàn)癥狀往往已是中晚期?，F(xiàn)今診斷結(jié)直腸癌仍然是以結(jié)腸鏡檢查為金標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)腸鏡檢查是一種侵入性的檢查，不但存在暴露患者隱私的情況，而且要求患者行徹底的腸道準(zhǔn)備，患者往往耐受較差，此外，此種檢查還有可能發(fā)生出血、穿孔等并發(fā)癥。因此，人們迫切需要一種非侵入性、易耐受、方便、快速的檢測方法來開展大規(guī)模的人群篩查，以降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率。本文就非侵入性結(jié)直腸癌篩查方法進(jìn)行綜述。

1 便隱血的檢測

便隱血檢測被認(rèn)為是最簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的無創(chuàng)結(jié)直腸癌初篩方法[3]。便隱血檢測分為化學(xué)法和免疫法?；瘜W(xué)法便隱血檢測以愈創(chuàng)木脂法為代表，目前最常用的是匹拉米洞法。匹拉米洞是呈色指示劑，其在酸及H2O2的作用下，與血紅蛋白反應(yīng)，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。此種方法操作簡單、成本低，適用于上消化道出血的臨床糞便隱血篩查及健康人群體檢。但該方法受飲食成分（動(dòng)物血、動(dòng)物臟器和含葉綠素類食物）及藥物（鐵劑、中藥和維生素C等）的影響，假陽性率較高。免疫法便隱血檢測以膠體金法為主，運(yùn)用特異性抗體檢測人血紅蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白，其方法不易受食物和藥物影響。血紅蛋白免疫法不適用于上消化道出血，由于腸道內(nèi)細(xì)菌分泌的酶能降解血紅蛋白，破壞其免疫原性，使血紅蛋白失去與抗體結(jié)合的能力，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。而轉(zhuǎn)鐵蛋白能對(duì)抗細(xì)菌的分解，二者聯(lián)合應(yīng)用檢測消化道出血的敏感性和特異性明顯升高[4]。有研究報(bào)道采用此種膠體金免疫法檢測便隱血，篩檢結(jié)直腸癌的敏感性為51%～70%[5]。便隱血篩查結(jié)直腸癌的必要條件是有出血，對(duì)暫無出血的腫瘤可出現(xiàn)漏診，且許多炎癥、痔瘡、消化道出血和部分正常人不同程度的出血亦能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，所以便隱血檢測的敏感性和特異性尚需提高。

2 相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的檢測

2.1 糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）的檢測

癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是一種酸性糖蛋白，廣泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞表面，是最早應(yīng)用于臨床的結(jié)直腸癌相關(guān)抗原，是美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)唯一推薦用于結(jié)直腸癌監(jiān)測的腫瘤標(biāo)志物。高水平的CEA與結(jié)直腸癌的進(jìn)程有關(guān)，主要見于結(jié)直腸癌Dukes分期的中晚期，在結(jié)直腸癌 Dukes C、D期時(shí)陽性率可達(dá)70%以上，而在Dukes A、B期時(shí)陽性率只有30%左右，且在不少良性疾病中也可升高[6]。

CA19-9是唾液酸衍生物，屬于黏蛋白型的糖類蛋白腫瘤標(biāo)志物，與Lewis血型成分有關(guān)，在胎兒的胃腸、胰腺、膽囊等消化細(xì)胞上皮中被發(fā)現(xiàn)，正常成人胰腺、膽管等亦能合成，但含量甚微，CA19-9升高主要見于消化系統(tǒng)腫瘤，因而也被用于結(jié)直腸癌的檢測，但其是腺癌特異的腫瘤標(biāo)志物，缺乏器官特異性，在胰腺癌中的陽性率為80%，在結(jié)直腸癌中的陽性率僅為35%[7]。

其他CA還有CA242、CA125、CA50、CA72-4等，種類繁多，但單個(gè)抗原的敏感性和特異性均不高，使其在臨床實(shí)際應(yīng)用中受到了很大的限制。為解決這一問題，臨床上多考慮使用多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測，以提高檢測的敏感性及特異性。劉琳等[8]研究了CEA、CA19-9、CA125、CA242、CA50這5種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測診斷結(jié)直腸癌的敏感性為71.38%，特異性為80.49%，準(zhǔn)確度為81.56%，高于各腫瘤標(biāo)志物單項(xiàng)檢測（各腫瘤標(biāo)志物單獨(dú)檢測的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度分別為CEA 48.23%、79.75%、62.08%，CA19-9 41.08%、85.73%、67.91%，CA125 50.96%、71.58%、64.28%，CA242 55.17%、92.64%、70.42%，CA50 44.96%、87.42%、59.38%）。聯(lián)合檢測具有更高的敏感性及準(zhǔn)確性，并對(duì)結(jié)直腸癌疾病的鑒別診斷以及結(jié)直腸癌的分期判斷具有積極的意義。

2.2 腫瘤M2型丙酮酸激酶（tumor M2 pyruvate kinase，tM2-PK）

M2型丙酮酸激酶是糖酵解限速酶丙酮酸激酶的一種同工酶，即胚胎型同工酶，在正常細(xì)胞中主要為高活性的四聚體，而在腫瘤細(xì)胞中則主要以低活性的二聚體形式存在，這種二聚體形式與磷酸烯醇式丙酮酸呈低親和性，使磷酸烯醇類物質(zhì)堆積于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，以合成腫瘤細(xì)胞代謝所需的核苷酸、氨基酸、磷脂，這種二聚體形式M2型丙酮酸激酶在所有增生細(xì)胞中均普遍表達(dá)， 在腫瘤細(xì)胞中呈過度表達(dá)，所以稱此型為tM2-PK[9]。tM2-PK是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型腫瘤標(biāo)志物，在消化系統(tǒng)腫瘤中高表達(dá)，對(duì)結(jié)直腸癌的早期篩查和療效評(píng)估具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

SCHNEIDER等[10]測定經(jīng)病理確診的各種消化系統(tǒng)腫瘤患者血漿tM2-PK水平，結(jié)果顯示對(duì)結(jié)直腸癌的診斷敏感性為48%，若與CEA聯(lián)合檢測，診斷結(jié)直腸癌的敏感性可提高到63%。喻鑫等[11]檢測68例結(jié)直腸癌患者和40名健康體檢者血清tM2-PK水平，當(dāng)tM2-PK的臨界值為15 U/mL 時(shí)其診斷結(jié)直腸癌的敏感性為67.6%，特異性為85.0%。楊剛等[12]研究tM2-PK、CEA、CA19-9和CA72-4對(duì)結(jié)直腸癌的篩查價(jià)值，結(jié)果表明tM2-PK對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效能最高，敏感性為73.8%，特異性為86.1%。曾龍飛等[13]使用Logistic回歸和偏最小二乘判別分析模型評(píng)價(jià)幾種腫瘤標(biāo)志物對(duì)結(jié)腸癌的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示tM2-PK聯(lián)合CEA和CA19-9是較為理想的腫瘤標(biāo)志物組合，其診斷結(jié)腸癌的敏感性為82.3%，特異性為91.5%。腫瘤指標(biāo)的聯(lián)合檢測能在很大程度上提高結(jié)直腸癌診斷的敏感性，更好地篩查及監(jiān)測結(jié)直腸癌患者的病情。

腫瘤細(xì)胞黏附性低、更新快，胃腸道中脫落的腫瘤細(xì)胞不停地隨糞便排出體外，為結(jié)直腸癌糞便tM2-PK的檢測提供了樣本來源。有研究表明糞便中tM2-PK的敏感性甚至高于血清[14]。在HARDT等[15]的研究中，60例結(jié)直腸癌患者糞便tM2-PK的均值顯著高于對(duì)照組，在以4 U/mL為臨界值時(shí)，其檢測的敏感性為73%，特異性為78%，且tM2-PK的含量與結(jié)直腸癌的臨床分期密切相關(guān)。梁鋼等[16]通過Meta分析方法評(píng)價(jià)糞便tM2-PK檢測對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測糞便tM2-PK，15個(gè)研究的匯總結(jié)果顯示其診斷結(jié)直腸癌的敏感性為77%，特異性為77%，認(rèn)為該非侵入性檢測方法對(duì)結(jié)直腸癌的診斷效力中等，可作為結(jié)直腸癌診斷的一種輔助方法。但也有學(xué)者認(rèn)為tM2-PK敏感性高，特異性較低，用于結(jié)直腸癌的早期篩查容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[17]。tM2-PK能否用于臨床結(jié)直腸癌的篩查和診斷尚需更大樣本量的相關(guān)研究來驗(yàn)證。

3 基于分子水平的篩查

隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展及其檢測技術(shù)的日趨成熟，表觀遺傳學(xué)改變對(duì)腫瘤的診斷受到極大的關(guān)注。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與表觀遺傳學(xué)改變密切相關(guān)，這些表觀遺傳學(xué)的改變主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和微小RNA（microRNA，miRNA）調(diào)控。尤其是DNA的甲基化和miRNA的異常表達(dá)，常常發(fā)生在結(jié)直腸癌的早期，對(duì)其檢測有望成為提高結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)率、診斷正確率的新的無創(chuàng)傷性檢測方法。

3.1 DNA甲基化的檢測

DNA甲基化是腫瘤常見的表觀遺傳學(xué)改變，未致基因序列的改變，但基因表達(dá)受到影響。DNA甲基化主要包括2種形式，即抑癌基因的高甲基化和特異癌基因的低甲基化。特異癌基因的低甲基化激活癌基因，促進(jìn)腫瘤的生長。抑癌基因的高甲基化，抑制抑癌基因表達(dá)，使其不能發(fā)揮抑癌效應(yīng)，致使腫瘤的發(fā)生。目前研究多集中于啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化。CpG島高甲基化是結(jié)直腸癌形成的重要機(jī)制之一，常發(fā)生在結(jié)直腸癌的早期，因此，通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測血液、糞便中的這些甲基化物質(zhì)有可能成為結(jié)直腸癌早期篩查的方法[18]。

近年來，血漿中的細(xì)胞質(zhì)分裂基因9（septin 9，SEPT9）甲基化在結(jié)直腸癌和癌前病變中均有較高的檢出率，為結(jié)直腸癌早期診斷提供了較有前景的篩查指標(biāo)[19]。目前檢測SEPT9的試劑盒，如ColoVantage和EpiproColon 2.0，對(duì)結(jié)直腸癌1期和2期診斷的敏感性分別為87%和84%，對(duì)結(jié)直腸癌總的敏感性可達(dá)90%和95%[20]。在TóTH等[21]的研究中使用EpiproColon 2.0試劑盒檢測81例結(jié)直腸癌患者和53名健康對(duì)照者，其敏感性為81.5%，特異性為100.0%。GRüTZMANN等[22]比較了各種腫瘤及非腫瘤患者血漿中甲基化的SEPT9基因水平，結(jié)果顯示血漿中SEPT9甲基化對(duì)結(jié)直腸癌有較高的敏感性，結(jié)直腸癌患者的檢出率為72.0%，其他腫瘤為11.5%，非腫瘤疾病為13.0%，正常人為10.0%。而CHURCH等[23]利用檢測SEPT9進(jìn)行了一項(xiàng)7 941人的前瞻性篩查，以研究SEPT9檢測對(duì)早期無癥狀大腸癌的篩查敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測SEPT9對(duì)結(jié)直腸癌篩查的敏感性僅為48%，明顯低于已經(jīng)診斷為結(jié)直腸癌的病例對(duì)照研究。同樣，LEE等[24]使用SEPT9對(duì)韓國人進(jìn)行結(jié)直腸癌篩查，其敏感性也僅為36.6%。SEPT9造成的這種高、低敏感性的差異，究竟是由試劑盒的不同還是種族差異引起，還需要大量的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

在結(jié)直腸癌的早期或晚期均有一定量的異常甲基化片段從腫瘤病灶處脫落，隨糞便排出體外，通過特異性PCR檢測糞便中異常DNA甲基化情況，有可能成為結(jié)直腸癌有效、高特異性、無創(chuàng)性方法?！睹绹改c病學(xué)院結(jié)直腸癌篩查指南》已經(jīng)明確將糞便DNA檢測作為可選的篩查方法[25]。LI等[26]利用ColoSure試劑盒檢測人波形蛋白基因甲基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者糞便中人波形蛋白基因出現(xiàn)甲基化的比例為40.9%，明顯高于健康對(duì)照者。WANG等[27]研究糞便中分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzledrelated protein 2，SFRP2）基因甲基化在結(jié)直腸癌診斷中的價(jià)值，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組、進(jìn)展期腺瘤組、增生性息肉組和健康對(duì)照組中糞便樣本SFRP2甲基化陽性檢出率分別為87.0%、61.8%、42.3%、0.0%，特異性均為100.0%。MELOTTE等[28]研究發(fā)現(xiàn)糞便中NDRG4基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化在結(jié)直腸癌患者和正常人的發(fā)生率分別為86%和4%，且特異性達(dá)到93%。此外還有GATA4、HIC1、OSMR、TFPE2、SPG20和MGMT等。這些單個(gè)基因的甲基化檢測對(duì)結(jié)直腸癌診斷的敏感性往往比較低，幾種糞便基因甲基化聯(lián)合檢測可以使結(jié)直腸癌診斷的敏感性達(dá)到75%～91%[29]。

3.2 miRNA的檢測

miRNA是一類含18～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。許多表達(dá)異常的miRNA可通過干擾腫瘤致癌基因和抑制因子的正?；钚远诙喾N腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要的角色。有研究表明，結(jié)直腸癌患者和正常人miRNA的表達(dá)存在顯著差異，其在結(jié)直腸癌起始階段及進(jìn)展過程中起重要作用，且由于miRNA的生物學(xué)特性穩(wěn)定、不易降解，在外周血中和糞便中可穩(wěn)定存在而易被檢測到，miRNA的上述特性為結(jié)直腸癌早期篩查提供了可能[30]。

CHEN等[31]首次報(bào)道在結(jié)直腸癌患者血清中存在異常表達(dá)的miRNA，并通過比較結(jié)直腸癌患者及對(duì)照組血漿中的miRNA，發(fā)現(xiàn)14個(gè)miRNA僅在結(jié)直腸癌患者中表達(dá)。NG等[32]發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌患者血漿中miRNA-92a水平顯著升高，診斷結(jié)直腸癌的敏感性為89%，特異性為70%，miRNA-92a還可區(qū)分結(jié)直腸癌和其他胃腸道炎癥性疾病。HUANG等[33]在研究中發(fā)現(xiàn)血清miRNA-29a、miRNA-92a對(duì)進(jìn)展期結(jié)腸腺瘤的診斷敏感性和特異性分別為62.2%、84.7%和64.9%、81.4%，對(duì)結(jié)直腸癌的診斷敏感性和特異性分別為69.0%、89.1%和84.0%、71.2%。KANAAN等[34]測定了血漿miRNA-21對(duì)識(shí)別結(jié)直腸癌的特異性和敏感性，均可達(dá)到90%。檢測這些miRNA在血液中的異常表達(dá)，有望成為診斷結(jié)直腸癌的一種非侵入性的篩檢方法。

糞便中異常的miRNA可能來源于患者消化系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，并以分子或外泌體的形式存在于患者的消化管中。這些糞便異常miRNA被認(rèn)為是結(jié)直腸癌存在的可靠依據(jù)。因此，有研究者認(rèn)為糞便中的miRNA可能成為診斷結(jié)直腸癌的新的腫瘤標(biāo)志物[35]。在結(jié)直腸癌患者糞便中miRNA-224、miRNA-29a、miRNA-4478、miRNA-1295b-3p、miRNA-135、miRNA-143、miRNA-145、miRNA-21、miRNA-106a、miRNA-92a等的表達(dá)水平與正常人群相比存在明顯的差異[36-39]。WU等[36]研究發(fā)現(xiàn)糞便中miRNA-21獨(dú)立診斷結(jié)直腸癌的敏感性為55.7%，特異性為73.3%。國內(nèi)也有報(bào)道，糞便中的miRNA-21參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，Ⅲ、Ⅳ期患者miRNA-21的表達(dá)水平高于Ⅰ、Ⅱ期患者，低分化患者高于中高分化患者，腫瘤轉(zhuǎn)移患者高于非轉(zhuǎn)移患者[40]。LI等[37]的研究表明，在結(jié)直腸癌患者的糞便中，miRNA-143和miRNA-145的表達(dá)較在健康人明顯降低。MAZEH等[41]的研究顯示，通過檢測糞便中miRNA-16診斷結(jié)直腸癌的敏感性達(dá)到91%，特異性為72%。在國內(nèi)，薛亞晶等[42]對(duì)50例結(jié)直腸癌患者和50名健康對(duì)照者的糞便miRNA-141、miRNA-92a-3p水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組的糞便miRNA-141和miRNA-92a-3p水平明顯高于健康對(duì)照組，其敏感性和特異性分別為74%、92%和52%、92%。

4 結(jié)語

在結(jié)直腸癌的非侵入性篩查方法中糞便隱血的檢測簡便、易行且價(jià)格低廉，至今仍是一項(xiàng)重要的檢查方法，但其敏感性和特異性比較低；CA和酶類等相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的檢測，實(shí)現(xiàn)了批量篩查的目標(biāo)，但到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)結(jié)直腸癌的百分之百敏感以及特異的腫瘤標(biāo)志物，常需選擇幾項(xiàng)敏感性、特異性互補(bǔ)的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，以利于提高結(jié)直腸癌的陽性檢出率。表觀遺傳學(xué)的修飾在結(jié)直腸癌早期診斷中越來越受到重視，其與基因變化共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)病及發(fā)展過程，啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化和miRNA的異常表達(dá)等表觀遺傳學(xué)的改變已成為近幾年的研究熱點(diǎn)，尤其是其能在血液和糞便中被檢測到，敏感性和特異性也比較好，但其用于疾病的預(yù)防及治療還需要大量研究予以證實(shí)。

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