臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療戰(zhàn)傷的關(guān)鍵技術(shù)研究

郭德鑌，蔡學(xué)敏，阮光萍，朱向情，何 潔，趙 晶，王 強(qiáng)，王金祥，龐榮清，潘興華

由于高性能大規(guī)模殺傷武器的威力更加強(qiáng)大，可能在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致大批傷情復(fù)雜、傷勢(shì)嚴(yán)重的復(fù)合傷傷員，戰(zhàn)傷治療的困難超乎尋常，傳統(tǒng)救治觀念正在受到挑戰(zhàn)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSC）具有自我更新、快速生長(zhǎng)、多向分化、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)特點(diǎn)，用于戰(zhàn)傷治療可挽救生命和減少殘缺。

1 現(xiàn)代戰(zhàn)傷的特點(diǎn)

戰(zhàn)傷是人體遭受物理、化學(xué)、生物、精神等致傷因素作用后引起的人體結(jié)構(gòu)的完整性與功能破壞，包括創(chuàng)傷、失能、中毒、精神障礙等[1]。戰(zhàn)傷特點(diǎn)：（1）武器殺傷威力大、機(jī)制復(fù)雜、作用時(shí)間長(zhǎng)、傷情不易判斷、救護(hù)難度大；（2）一種武器有幾種殺傷機(jī)制，造成沖擊傷、燒傷、機(jī)械傷、輻射傷等多種傷情復(fù)合出現(xiàn)；（3）高技術(shù)武器傷涉及從分子、細(xì)胞、組織、器官到整體的損害，常傷及相鄰器官、遠(yuǎn)隔器官，甚至造成全身遲發(fā)性反應(yīng)，檢查、治療困難；（4）可能出現(xiàn)以往戰(zhàn)傷中沒(méi)有見(jiàn)過(guò)的微波、次聲、激光、超聲損傷，新武器、新致傷機(jī)制、新傷情；（5）高新武器的使用可導(dǎo)致不見(jiàn)創(chuàng)傷，但內(nèi)臟器官已嚴(yán)重?fù)p害的傷情，傷情隱蔽，常規(guī)檢查難以識(shí)別；（6）易發(fā)生應(yīng)激障礙，心理創(chuàng)傷救治需求突出。

2 UCMSC治療戰(zhàn)傷的原理

戰(zhàn)傷實(shí)際上是對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損害，常繼發(fā)缺血、感染、炎癥等，引起組織細(xì)胞變性、壞死、缺失，從而導(dǎo)致組織缺損和器官功能障礙。UCMSC治療機(jī)制是維護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、修復(fù)受損的細(xì)胞，再生或補(bǔ)充缺失的組織細(xì)胞。UCMSC具有自動(dòng)向損傷組織游走、遷移和歸巢的特性，即便通過(guò)靜脈輸入體內(nèi)，它也可以自己去尋找損傷組織，并遷移、定植于損傷組織中發(fā)揮治療作用[2]。UCMSC向損傷組織歸巢，就象炎癥反應(yīng)后大量白細(xì)胞遷移到炎癥組織一樣，能夠在損傷組織釋放的趨化因子、粘附分子、生長(zhǎng)因子、炎癥因子、整合素和酶等多種因素的協(xié)同作用下，通過(guò)趨化因子與UCMSC表面受體結(jié)合而驅(qū)動(dòng)并跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞，遷移至損傷組織。UCMSC的歸巢是一個(gè)多步驟、多因子參與的復(fù)雜過(guò)程，涉及趨化因子的吸引、生長(zhǎng)因子（HGF）的調(diào)節(jié)、整合素的協(xié)同、炎癥因子的促進(jìn)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的輔助等。UCMSC特異性歸巢決定于損傷組織釋放因子的吸引作用，而其表面表達(dá)的相應(yīng)受體決定其是否接受歸巢信號(hào)的指揮。損傷組織釋放的因子與UCMSC表面的相應(yīng)配體結(jié)合后，可驅(qū)動(dòng)UCMSC歸巢程序，沿著毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞壁滾動(dòng)，然后通過(guò)表達(dá)粘附分子、生長(zhǎng)因子及整合素家族成員等特異性分子黏附于毛細(xì)血管，再通過(guò)內(nèi)皮進(jìn)入靶組織[3]。

UCMSC可被誘導(dǎo)分化成脂肪、骨、肌肉、神經(jīng)、胰島等細(xì)胞，具備替代戰(zhàn)創(chuàng)傷中損傷細(xì)胞和重建組織器官的潛能。在體外誘導(dǎo)UCMSC定向分化，主要是通過(guò)在培養(yǎng)體系中添加特定的細(xì)胞因子、小分子化合物，或改變培養(yǎng)條件等。在體內(nèi)，UCMSC的分化具有組織特異性，其分化方向決定于組織微環(huán)境的作用。在戰(zhàn)傷條件下，歸巢到損傷組織的UCMSC可在組織微環(huán)境誘導(dǎo)下，定向分化為相應(yīng)的組織細(xì)胞，直接整合于組織中參與損傷修復(fù)。在放射傷、系統(tǒng)性炎癥、創(chuàng)傷、退變等治療中發(fā)現(xiàn)，不論是通過(guò)靜脈輸入、血管介入、腔隙注射還是定位移植的MSC均顯示有治療作用，可見(jiàn)有部分UCMSC遷移、歸巢至損傷組織中，可在組織微環(huán)境的誘導(dǎo)下分化為相應(yīng)組織類(lèi)型的功能細(xì)胞并整合于組織之中，參與損傷組織的結(jié)構(gòu)重建[4]。

UCMSC可分泌20多種涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的細(xì)胞因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、骨形成蛋白（GMP）、生長(zhǎng)分化因子 15、IL-6、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、血小板生長(zhǎng)因子（PDGF）、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）等[5]。 體內(nèi)研究證實(shí)，UCMSC通過(guò)旁分泌或遠(yuǎn)程分泌機(jī)制促進(jìn)損傷組織的原位細(xì)胞生長(zhǎng)。UCMSC分泌SCF、VEGF、NGF的功能比其他MSC更強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用更強(qiáng)大。UCMSC通過(guò)直接參與和分泌細(xì)胞因子兩種機(jī)制起協(xié)同促進(jìn)損傷修復(fù)。

UCMSC在合適的條件下可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成血管樣結(jié)構(gòu)。輸入體內(nèi)的UCMSC可分泌VEGF、TGF-β、HGF 等，這些細(xì)胞因子可以有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)和微血管再生。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，UCMSC可促進(jìn)肝腎纖維化、缺血損傷、股骨頭壞死組織的微血管再生，改善損傷組織的血液循環(huán)和促進(jìn)缺血性損傷組織的修復(fù)。

UCMSC可通過(guò)與免疫細(xì)胞直接接觸和分泌免疫調(diào)控因子發(fā)揮免疫與炎癥調(diào)節(jié)作用[6]。在體外，UCMSC與外周血單個(gè)核細(xì)胞接觸或非接觸培養(yǎng)，均明顯抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子的釋放，抑制抗原提呈細(xì)胞（DC）的成熟和NK細(xì)胞的活性，促進(jìn)CD4+、CD25+T細(xì)胞增殖。在免疫與炎癥調(diào)節(jié)作用中，參與因素有：一氧化氮(NO)、前列腺素 E2(PGE2)、IL-10，TGF-β1、HGF、吲哚胺 2,3-doxygenase(IDO)、甲狀旁腺激素(PTH)、BMP 和 IFN-γ等。PGE2是UCMSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要介導(dǎo)因子，而炎癥細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1等能顯著上調(diào)UCMSC分泌PGE2。UCMSC對(duì)免疫功能有雙向調(diào)節(jié)作用，即高劑量抑制血淋巴細(xì)胞增殖，低劑量刺激淋巴細(xì)胞增殖，在強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)時(shí)抑制免疫細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)合成與釋放，在低炎癥反應(yīng)促進(jìn)免疫功能。

UCMSC 釋放的外泌體（exosomes，Exo）也具有傳遞細(xì)胞間信號(hào)、清理細(xì)胞內(nèi)“垃圾”以及參與免疫調(diào)節(jié)的作用[7]。人UCMSC外泌體（hucMSC-exo）可明顯抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)CD4+、CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比率升高，抑制PBMC產(chǎn)生炎癥相關(guān)因子，如IFNγ、IL-6、TNF-α，并且具有劑量依賴(lài)性。hucMSC-exosome的典型特征是促進(jìn)損傷修復(fù)，在蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA等水平，將特定的內(nèi)容物傳遞至靶細(xì)胞中，激活或抑制某些信號(hào)通路或信號(hào)蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、血管再生以及免疫等多種途徑發(fā)揮組織修復(fù)功能。hucMSC-exosome可以降低血管再灌注損傷，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖和抑制其凋亡，促進(jìn)神經(jīng)及血管再生，加快傷口愈合，促進(jìn)細(xì)胞增殖且抑制細(xì)胞凋亡。

在UCMSC治療實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將獼猴的UCMSC以3×106細(xì)胞/kg的劑量輸入肺纖維化的老年獼猴體內(nèi)，1次/w，連續(xù)輸入3次，3個(gè)月后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺纖維化程度減輕，腦血流灌注增加，腎小球?yàn)V過(guò)率提高，同時(shí)還可見(jiàn)到外周血中的超氧化物歧化酶（SOD）、端粒酶含量升高。在UCMSC對(duì)卵巢衰老小鼠的干預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，UCMSC可降低衰老相關(guān)基因表達(dá)水平，提高細(xì)胞自噬能力。說(shuō)明UCMSC可通過(guò)提高抗氧化應(yīng)激能力、促進(jìn)細(xì)胞自吞噬和調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)損傷修復(fù)。

3 UCMSC在戰(zhàn)傷治療中的作用

UCMSC具有防治戰(zhàn)傷后組織細(xì)胞變性、壞死和進(jìn)行組織損傷的修復(fù)、替代等作用。

組織器官功能維護(hù)與再生[8]：UCMSC治療具有減輕繼發(fā)性損傷、促進(jìn)損傷再生修復(fù)、挽救生命和減低致殘率的作用。MSC促進(jìn)各種組織損傷的修復(fù)作用已經(jīng)在局部或全身性損傷疾病模型治療研究中得以證實(shí)，主要結(jié)果有：（1）對(duì)機(jī)械性、缺血性、中毒性、放射性組織損傷，甚至是一些組織損傷不明確的器官功能障礙性疾病均顯示療效；（2）不同類(lèi)型的組織損傷，在接受UCMSC治療后,均發(fā)現(xiàn)有一定數(shù)量的UCMSC分布及分化，說(shuō)明UCMSC參與了損傷修復(fù)；（3）UCMSC治療損傷的療效起決于微環(huán)境條件對(duì)急性損傷的療效更顯著；（4）對(duì)自身免疫、炎癥等導(dǎo)致的組織損傷治療獲得了肯定療效。

防控炎癥反應(yīng)[9]：武器傷導(dǎo)致的燒創(chuàng)傷、缺血及再灌注損傷等易引發(fā)傷員過(guò)度釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），誘發(fā)發(fā)多器官功能不全（MODS）。SIRS是機(jī)體受到嚴(yán)重傷害引起的炎癥反應(yīng)失控和自我破壞，是導(dǎo)致戰(zhàn)傷之后組織器官損傷和非現(xiàn)場(chǎng)死亡的重要原因。SIRS救治關(guān)鍵是控制血液循環(huán)中的炎癥啟動(dòng)因子、炎癥介質(zhì)及細(xì)胞裂解產(chǎn)物的濃度，阻斷炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)。UCMSC治療SIR可防止或阻斷SIR過(guò)程中的細(xì)胞因子瀑布效應(yīng)和炎癥介質(zhì)釋放，防止傷情發(fā)展。UCMSC具有強(qiáng)大的抗炎和調(diào)節(jié)免疫功能的作用，不論是給創(chuàng)傷性還是感染性、中毒性急慢性炎癥反應(yīng)的患者輸入U(xiǎn)CMSC，均可見(jiàn)到炎癥反應(yīng)癥狀減輕或消失，組織內(nèi)炎性細(xì)胞減少，同時(shí)還可抑制組織細(xì)胞的凋亡。

組織工程：UCMSC可用于培育具有三維結(jié)構(gòu)的生物組織或器官，并用于組織缺損的修復(fù)治療。目前，包含活性細(xì)胞的人工骨、皮膚、血管、角膜等已被研制成功，并在動(dòng)物模型治療實(shí)驗(yàn)中取得成功。在戰(zhàn)傷治療中，可通過(guò)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，按照需要修復(fù)組織的特定尺寸和形狀，將UCMSC、生物材料、生長(zhǎng)因子等多元材料的混合物通過(guò)3D打印的辦法，快速、精準(zhǔn)制造出符合戰(zhàn)傷治療要求的生物組織，甚至是復(fù)雜的組織或器官。將骨髓MCS與可降解生物材料復(fù)合培養(yǎng)后移植于骨缺損組織，MSC可增殖分化為骨細(xì)胞，形成骨組織。將MSC與特定的粘合劑、生長(zhǎng)因子復(fù)合，用3D噴墨打印技術(shù)將復(fù)合材料噴涂在血管支架的內(nèi)外層上并移植于靈長(zhǎng)動(dòng)物體內(nèi)取得成功。將VEGF基因轉(zhuǎn)染MSC后與真皮支架材料一起植入全層皮膚缺損的模型，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)人工皮膚的血管化及創(chuàng)面愈合。人工構(gòu)建包含附屬血管、汗腺、皮脂腺等的人工皮膚已獲得成功。將生長(zhǎng)因子基因?qū)隡SC，可促進(jìn)皮膚、血管細(xì)胞生長(zhǎng)和損傷修復(fù)。

高新武器傷治療[10]：高新武器傷涉及基因?qū)用娴臄嗔?、突變，大分子功能蛋白的破壞，?xì)胞和組織器官的結(jié)構(gòu)破壞等，常造成組織細(xì)胞可逆或不可逆損害，常規(guī)藥物治療作用甚微。UCMSC用于高新武器傷治療具有多重生物效應(yīng)，可通過(guò)直接參與、分泌多種因子和提升抗氧化應(yīng)激能力等，從基因到整體不同層次發(fā)揮治療作用。在基因水平，UCMSC具有促進(jìn)DNA修復(fù)的功能，能夠快速、高效地識(shí)別輻射引起的DNA損傷，通過(guò)啟動(dòng)同源重組、非同源性末端接合等途徑進(jìn)行DNA雙鏈斷裂的迅速修復(fù)。在發(fā)射性肺損傷治療中，UCMSC通過(guò)分化成肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞因子表達(dá)減輕肺水腫，修復(fù)損傷的肺組織，提高生存率，而且較低劑量就能遷移歸巢至損傷部位發(fā)揮作用。在細(xì)胞水平，將MSC移植于放射線(xiàn)照射的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)，MSC可分布于全身個(gè)組織，促進(jìn)創(chuàng)傷局部成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膠原纖維、毛細(xì)血管增加。UCMSC治療持續(xù)感染和壞死時(shí)，可通過(guò)分化和旁分泌作用調(diào)節(jié)局部微環(huán)境平衡，促進(jìn)創(chuàng)面組織的血管內(nèi)皮、表皮和成纖維細(xì)胞增殖及放射傷創(chuàng)面愈合。在視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜光損傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變等動(dòng)物模型中，MSC可通過(guò)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，抑制視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)和病理?yè)p害，減輕或延緩視網(wǎng)膜組織損傷。MSC可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)節(jié)、向肝細(xì)胞樣分化、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)血管再生等機(jī)制治療微波、貧鈾彈等導(dǎo)致的急性肝功能衰竭。

4 展望

UCMSC是所有干細(xì)胞中“成藥”性能最強(qiáng)的干細(xì)胞之一，是一種戰(zhàn)傷修復(fù)的理想“細(xì)胞藥品”，對(duì)促進(jìn)戰(zhàn)傷中受損傷組織的修復(fù)、防控SIRS和構(gòu)建用于戰(zhàn)傷修復(fù)的人工組織器官具有特別重要的軍事醫(yī)學(xué)價(jià)值，特別是對(duì)高新技術(shù)武器傷治療具有多種生物效應(yīng)，滿(mǎn)足多層次復(fù)合損傷的治療需求，其他細(xì)胞和傳統(tǒng)藥物難以替代。UCMSC在戰(zhàn)傷救治中的優(yōu)勢(shì)是材料來(lái)源充足，無(wú)倫理限制和免疫排斥問(wèn)題，可以大規(guī)模、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，對(duì)戰(zhàn)傷治療具有通用性。本課題組建立了人UCMSC大規(guī)模體外制備技術(shù)體系，通過(guò)對(duì)神經(jīng)、骨、心、肝、肺、腎、胰等局部損傷和放射傷、老年退變、SLE、SIRS等全身性損傷動(dòng)物模型的UCMSC治療研究，結(jié)果顯示異體或異種UCMSC治療無(wú)明顯免疫排斥反應(yīng)，對(duì)不同類(lèi)型的損傷的不同階段均顯示有一定治療作用，提示UCMSC對(duì)各種戰(zhàn)傷，在早、中、后期均可發(fā)揮治療作用。UCMSC的作用機(jī)制涉及UCMSC定向歸巢、分化、分泌生長(zhǎng)因子、調(diào)節(jié)炎癥與免疫、促進(jìn)血管再生和提高抗氧化應(yīng)激能力等。前期研究解決了UCMSC治療損傷性疾病臨床前關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題，進(jìn)一步的研究任務(wù)是建立臨床研究技術(shù)及規(guī)范，通過(guò)臨床研究驗(yàn)證UCMSC的療效與安全性，使其成為戰(zhàn)傷治療的產(chǎn)品和技術(shù)。

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