流式細(xì)胞術(shù)外周血白細(xì)胞分類方法的建立和性能評(píng)價(jià)

宋 穎， 韓姣姣， 趙 強(qiáng)， 徐 翀

（上海市臨床檢驗(yàn)中心臨床血液體液學(xué)研究室，上海 200126）

外周血白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)對(duì)感染和血液系統(tǒng)疾病的診斷和治療有重要意義。隨著臨床實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化程度的不斷提高，全自動(dòng)五分類血液分析儀已成為主流儀器。在快速獲得白細(xì)胞分類結(jié)果的同時(shí)，儀器分類結(jié)果的可靠性驗(yàn)證、分類結(jié)果室內(nèi)質(zhì)控失控后的處理、室間質(zhì)評(píng)超出范圍后的原因分析等問(wèn)題也日益顯現(xiàn)。

目前，各品牌血液分析儀配套校準(zhǔn)品中均未包含白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參數(shù)，白細(xì)胞分類結(jié)果的可靠性一般是根據(jù)WS/T 246—2005《白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法》[1]的要求進(jìn)行評(píng)估，導(dǎo)致不同品牌，甚至同品牌不同型號(hào)的全自動(dòng)血液分析儀白細(xì)胞分類結(jié)果可比性較差?，F(xiàn)有的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法基于操作人員顯微鏡下觀察染色血涂片的結(jié)果，具有很強(qiáng)的主觀性，存在操作人員技術(shù)水平差異較大、觀察區(qū)內(nèi)細(xì)胞分布不均勻、觀察細(xì)胞數(shù)量有限、精密度差等諸多問(wèn)題。流式細(xì)胞分析可大大提高分析細(xì)胞的數(shù)量，單克隆抗體的特異性結(jié)合也能提高對(duì)細(xì)胞的識(shí)別能力，建立基于流式細(xì)胞術(shù)原理的白細(xì)胞分類方法有重要的實(shí)際意義。本研究參照國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）相關(guān)指南的建議[2]，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行外周血白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，并與全自動(dòng)血液分析儀和顯微鏡鏡檢分類結(jié)果進(jìn)行比較，以期建立一種可有效補(bǔ)充原有手工分類計(jì)數(shù)法的流式細(xì)胞術(shù)白細(xì)胞分類方法，進(jìn)一步提高臨床血常規(guī)檢測(cè)中白細(xì)胞分類的準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

選取2021年8月—2022年3月上海市臨床檢驗(yàn)中心健康體檢者50名，其中男23名、女27名，年齡24～58歲。排除有腫瘤、感染、自身免疫、心腦血管疾病等病史者。納入標(biāo)準(zhǔn)：血常規(guī)和肝功能、腎功能、血脂、血糖等常規(guī)生化項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)。

1.2 儀器和試劑

日本Sysmex公司XN-20A1全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑、SP1000全自動(dòng)推片染色儀。日本Olympus公司BX51光學(xué)顯微鏡。美國(guó)Cytek公司NL-CLC全光譜流式細(xì)胞儀；美國(guó)BD公司熒光標(biāo)記單克隆抗體[3]（CD16-Pacific Blue，克隆號(hào)為3G8；CD45-V500，克隆號(hào)為HI30；CD7-PE，克隆號(hào)為M-T701；CD123-PerCP-Cy5.5，克隆號(hào)為7G3；CD14-PECy7，克隆號(hào)為M5E2；CD3-APC，克隆號(hào)為HIT3a；CD19-APC，克隆號(hào)為HIB19；CD11b-APC-Cy7，克隆號(hào)為ICRF44）；美國(guó)賽默飛世爾公司SYTO 16 綠色熒光核酸染色劑（貨號(hào)S7578）。樣本檢測(cè)當(dāng)日確保儀器室內(nèi)質(zhì)控在控。

1.3 方法

采集每位研究對(duì)象晨起空腹外周血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，3份分裝，分別采用3種方法檢測(cè)：（1）顯微鏡鏡檢（手工法），將樣本顛倒混勻后，用全自動(dòng)推片染色儀制備成血涂片，并行瑞氏染色，由2位具備讀片能力的技師按照白細(xì)胞分類參考方法[1]分別進(jìn)行200個(gè)白細(xì)胞分類鏡檢（合計(jì)400個(gè)白細(xì)胞），并記錄結(jié)果。（2）全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)（儀器法），采用全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行全血細(xì)胞計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類[中性粒細(xì)胞（neutrophil，NEUT）、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，LYMPH）、單核細(xì)胞（monocyte，MONO）、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，EOS）、嗜堿性粒細(xì)胞（basophil，BASO）]計(jì)數(shù)。（3）全光譜流式細(xì)胞儀檢測(cè)（流式法），在絕對(duì)值計(jì)數(shù)管中分別加入樣本和單克隆抗體CD16-Pacific Blue、CD45-V500、CD7-PE、CD123-PerCPCy5.5、CD14-PE-Cy7、CD3-APC、CD19-APC、CD11b-APC-Cy7、SYTO 16進(jìn)行單克隆熒光染色，采用全光譜流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Medcalc軟件（version 20）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以手工法為參考方法，評(píng)價(jià)流式法和儀器法白細(xì)胞分類結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用Passing&Bablok回歸分析對(duì)3種方法白細(xì)胞分類結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，以回歸方程（Y=a+bX）和概率值（P）表示?；貧w方程通過(guò)概率值（P）、95%可信區(qū)間、斜率（b）和截距（a）、數(shù)據(jù)分布趨勢(shì)4個(gè)方面進(jìn)行分析。概率值（P）≥0.05表示回歸線性模型與數(shù)據(jù)的匹配程度具有相關(guān)性，斜率b越接近1，截距a越接近0，表示2種方法白細(xì)胞分類結(jié)果相關(guān)性越好。

2 結(jié)果

2.1 流式法和儀器法白細(xì)胞分類結(jié)果準(zhǔn)確性

以手工法為參考方法，流式法中性粒細(xì)胞百分比（neutrophil percentage，NEUT%）、淋巴細(xì)胞百分比（lymphocyte percentage，LYMPH%）、單核細(xì)胞百分比（monocyte percentage，MO%）、嗜酸性粒細(xì)胞百分比（eosinophil percentage，EO%）、嗜堿性粒細(xì)胞百分比（basophil percentage，BASO%）項(xiàng)目分別有49、50、50、50、48例在95%可信區(qū)間內(nèi)。儀器法NEUT%、LYMPH%、MO%、BASO%、EOS%分別有49、49、48、48、40例在95%可信區(qū)間內(nèi)。按照99%的可信區(qū)間標(biāo)準(zhǔn)，流式法和儀器法所有白細(xì)胞分類比對(duì)結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)。

2.2 按流式法邏輯門(mén)判斷的白細(xì)胞分類結(jié)果

本研究流式法所采用的抗體組合類型為單克隆抗體，包括CD16-Pacific Blue、CD45-V500、SYTO16、CD7-PE、CD123-PerCP-Cy5.5、CD14-PE-Cy7、CD3+CD19-APC、CD11b-APC-Cy7。ICSH指南[2]未列出邏輯門(mén)，本研究采用的設(shè)門(mén)邏輯見(jiàn)圖1，流式法不同分類白細(xì)胞與相應(yīng)抗體的反應(yīng)性見(jiàn)表1。

圖1 流式法白細(xì)胞分類的邏輯門(mén)設(shè)置

表1 不同分類白細(xì)胞對(duì)相應(yīng)抗體（組合）的反應(yīng)性

2.3 手工法、流式法、儀器法回歸分析結(jié)果

手工法與儀器法、手工法與流式法、儀器法與流式法NEUT%的回歸方程分別為Y=-1.13+0.99X（P=0.68）、Y=-0.96+0.98X（P=0.89）、Y=-1.53+1.01X（P=0.89），LYMPH%的回歸方程分別為Y=1.79+0.94X（P=0.89）、Y=2.64+0.94X（P=0.26）、Y=0.90+0.98X（P=0.89），MO%的回歸方程分別為Y=2.69+0.76X（P=0.42）、Y=2.74+0.68X（P=0.68）、Y=-0.11+0.97X（P=0.44），EO%的回歸方程分別為Y=0.25+0.93X（P=0.89）、Y=0.29+0.86X（P=0.44）、Y=0.01+1.00X（P=0.38），BASO%的回歸方程分別為Y=0.26+0.12X（P=0.44）、Y=0.30+0.50X（P=0.30）、Y=-0.23+2.33X（P=0.89）。NEUT%項(xiàng)目和LYMPH%項(xiàng)目的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均在95%可信區(qū)間范圍內(nèi)，MO%項(xiàng)目和EO%項(xiàng)目有個(gè)別數(shù)據(jù)點(diǎn)落在95%可信區(qū)間外。儀器法與流式法的BASO%項(xiàng)目有個(gè)別數(shù)據(jù)點(diǎn)落在95%可信區(qū)間外。見(jiàn)圖2。

圖2 NEUT%、LYMPH%、MO%、EO%、BASO%項(xiàng)目手工法、流式法、儀器法兩兩回歸分析結(jié)果

從回歸方程的斜率和截距可見(jiàn)，按方法學(xué)進(jìn)行比對(duì)，表現(xiàn)較佳的是儀器法與流式法的相關(guān)性。按項(xiàng)目進(jìn)行比對(duì)，表現(xiàn)較佳的是NEUT%和LYMPH%；儀器法與流式法EO%的回歸方程表現(xiàn)最佳；BASO%項(xiàng)目3種方法兩兩比較的回歸方程表現(xiàn)欠佳。

從回歸方程的數(shù)據(jù)分布趨勢(shì)可見(jiàn)，MO%項(xiàng)目流式法與儀器法在細(xì)胞數(shù)量較低時(shí)的結(jié)果均高于手工法。MO%項(xiàng)目?jī)x器法與流式法有很好的相關(guān)性。BASO%項(xiàng)目手工法與流式法、手工法與儀器法的數(shù)據(jù)離散程度較大，集中趨勢(shì)不明顯。BASO%項(xiàng)目流式法與儀器法數(shù)據(jù)分布呈比例，流式法的檢測(cè)結(jié)果約為儀器法的2倍。

3 討論

目前，臨床血常規(guī)檢測(cè)中白細(xì)胞分類結(jié)果的參考方法仍然為手工法，此方法建立已有近20年的時(shí)間。由于手工分類的局限性，基于泊松分布的可信區(qū)間的比對(duì)已不適用于現(xiàn)有血液分析儀對(duì)分類結(jié)果的需求。由于血液分析儀的校準(zhǔn)項(xiàng)目中不包含白細(xì)胞分類，實(shí)驗(yàn)室在校準(zhǔn)白細(xì)胞分類過(guò)程中常會(huì)遇到各種困難：（1）按手工分類參考方法的允許范圍判斷血液分析儀分類結(jié)果符合要求，且血細(xì)胞分類室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果在控，無(wú)法解釋室間質(zhì)評(píng)血液分析儀白細(xì)胞分類結(jié)果超出允許范圍；（2）儀器工程師調(diào)整白細(xì)胞分類靈敏度系數(shù)沒(méi)有依據(jù)，無(wú)法驗(yàn)證可靠性；（3）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的多臺(tái)血液分析儀分類結(jié)果可比性差，無(wú)法確定靶機(jī)；（4）血液分析儀提示異常細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行驗(yàn)證，即血涂片中未發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞。

為了解決這些問(wèn)題，近十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外多名專家[3-11]分別發(fā)表了基于不同配色方案的流式細(xì)胞儀白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)法。隨著流式細(xì)胞儀硬件和技術(shù)的不斷進(jìn)步，熒光檢測(cè)通道數(shù)量大大增加，且熒光素種類也更加豐富，不斷推動(dòng)單管多色檢測(cè)的發(fā)展。ICSH指南[2]指出，要建立新的流式細(xì)胞術(shù)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法至少需要8色熒光或更多色抗體組合，才能從技術(shù)上滿足要求。

縱觀近十年的外周血白細(xì)胞分類流式法的進(jìn)展，主要聚焦在6個(gè)方面：（1）采用的流式細(xì)胞儀機(jī)型更新?lián)Q代；（2）采用的熒光素由5色（FITC、PE、ECD、Cy5、Cy7）增加到10色（Pacific Blue、FITC、PE、PE-Texas Red、PCX、PE-Cy7、Alexa 594、APC、A700、APCCy7）；（3）采用的抗體數(shù)量由6種（CD45、CD36、CD2、CRTH2、CD19、CD16）增加到29種（CD45、κ、λ、CD19、CD34、CD20、CD10、CD5、CD2、CD7、CD8、CD3、CD4、HLA-DR、CD15、CD33、CD117、CD13、CD38、CD71、CD64、CD14、CD16、CD123、CD36、DAPI、cκ、cλ、CD56）；（4）樣本處理方式由多管溶血后洗滌法轉(zhuǎn)變?yōu)閱喂苋苎庀捶ǎ唬?）計(jì)數(shù)更加精確，由細(xì)胞相對(duì)百分比計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)榻^對(duì)值計(jì)數(shù)（絕對(duì)值計(jì)數(shù)管的使用）。

考慮到流式細(xì)胞儀的檢測(cè)能力和單克隆抗體熒光通道使用的數(shù)量，ICSH在2014年的指南[2]中列出了8色的配色方案（CD16-Pacific Blue、CD45 Krome Orange、SYTO16、CD7-PE、CD123-PerCP-Cy5.5、CD14-PE-Cy7、CD3+CD19-APC、CD11b-APC-A750），但至今未見(jiàn)最終報(bào)告發(fā)表。本研究建立了基于此配色方案的實(shí)際應(yīng)用方法，并進(jìn)行初步驗(yàn)證。從細(xì)胞分布看，各群細(xì)胞集中趨勢(shì)明顯，且均能被很好地區(qū)分；采用CD45/SSC、CD3、CD19和CD7的抗體組合識(shí)別NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，采用雙抗體結(jié)合的方式（CD16+和CD45+定義NEUT，CD123+和CD11b+定義BASO）識(shí)別部分LYMPH，提高了細(xì)胞識(shí)別的可靠性。

本研究還分析了不同方法白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)按照原有的手工法分類標(biāo)準(zhǔn)，流式法與血液分析儀法均符合要求，但無(wú)法滿足血液分析儀分類靈敏度調(diào)整的需求。原因可能為：（1）手工法的細(xì)胞分類數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于其他2種方法，對(duì)于特征細(xì)胞群的檢出率低，如手工分類400個(gè)白細(xì)胞，BASO的檢出率仍可能為0；（2）手工分類依靠檢測(cè)人員主觀識(shí)別，對(duì)于識(shí)別者技術(shù)要求高，某些形態(tài)變異的細(xì)胞不能被有效識(shí)別；（3）質(zhì)控品說(shuō)明書(shū)所示部分細(xì)胞來(lái)源為動(dòng)物替代細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞大小的空間布局來(lái)確認(rèn)儀器分類性能的穩(wěn)定性，而無(wú)法確認(rèn)其準(zhǔn)確性。儀器法和流式法的基礎(chǔ)均是流式細(xì)胞分析，僅是細(xì)胞鑒別的熒光素不同，血液分析儀采用熒光染液，流式細(xì)胞儀采用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體；單克隆抗體具有很強(qiáng)特異性，通過(guò)多標(biāo)記結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)目的細(xì)胞群的精確識(shí)別，特別是對(duì)于外周血細(xì)胞中所占比例不高的細(xì)胞群體的識(shí)別（如BASO）優(yōu)于傳統(tǒng)手工法。從本研究匯總數(shù)據(jù)的回歸方程看，3種方法NEUT、LYMPH分類結(jié)果具有可比性，儀器法與流式法的相關(guān)性優(yōu)于另外2種組合。對(duì)于EOS的分類，儀器法與流式法結(jié)果高度一致。對(duì)于MONO的分類，流式法和儀器法在低值區(qū)域的識(shí)別率高于手工法。對(duì)于BASO的分類，流式法具有最佳的識(shí)別能力，可能與單克隆抗體的特異性識(shí)別有關(guān)。

本研究進(jìn)行了單管8色流式法計(jì)數(shù)的探索，目的是提高外周血白細(xì)胞分類的準(zhǔn)確性和精確性，為全自動(dòng)血液分析儀白細(xì)胞分類提供技術(shù)保障。通過(guò)流式法對(duì)白細(xì)胞分類結(jié)果進(jìn)行賦值，從而部分替代形態(tài)學(xué)方法驗(yàn)證血液分析儀分類結(jié)果的可靠性。此種方法在比例較低的細(xì)胞群體的驗(yàn)證方面具有較好的性能表現(xiàn)，如MONO、BASO可以通過(guò)流式特異性抗體結(jié)合的方法驗(yàn)證血液分析儀分類的可靠性。研究流式細(xì)胞術(shù)白細(xì)胞分類法的最主要目的不是將其作為臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，而是幫助全血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)儀的生產(chǎn)企業(yè)借助此參考方法在儀器研發(fā)、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的定值方面有所突破[2]，從儀器生產(chǎn)的源頭有效提高各儀器檢測(cè)結(jié)果的一致性。作為質(zhì)量監(jiān)管部門(mén)，可以通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)這一新的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)方法對(duì)新鮮全血進(jìn)行賦值，評(píng)估并監(jiān)控臨床實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的一致性。同時(shí)也可以在正確度驗(yàn)證活動(dòng)中對(duì)表現(xiàn)不佳的儀器進(jìn)行技術(shù)改良或革新。

綜上所述，本研究建立的8色流式細(xì)胞術(shù)白細(xì)胞分類方法可同時(shí)適用于上游的生產(chǎn)廠家和下游的終端用戶（臨床實(shí)驗(yàn)室），對(duì)快速、有效地提高白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性具有重要意義。當(dāng)然，如果臨床實(shí)驗(yàn)室能夠投入人力、物力和技術(shù)建立這一流式細(xì)胞術(shù)白細(xì)胞分類方法，不僅可以日常監(jiān)控全自動(dòng)血液分析儀的工作性能，對(duì)血液胞分析儀報(bào)警樣本進(jìn)行準(zhǔn)確復(fù)核，還能及時(shí)對(duì)特征細(xì)胞群體作出初步確認(rèn)。