棕果番茄gf位點(diǎn)等位基因的分子檢測(cè)

曹丹丹　孫朝輝　任平平　宋瑩　程斐

摘要：紅果番茄GF基因位點(diǎn)的綠果肉（green-flesh，gf）突變體有g(shù)f、gf²、gf³、gf⁴、gf⁵共5種等位基因，因其特殊的果實(shí)顏色而受到大眾喜愛。筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，gf位點(diǎn)突變體具有抗番茄褪綠病毒病的功能，但有些棕果番茄并不是gf位點(diǎn)突變體。從300份候選材料中選取6份棕果番茄材料，并以易感褪綠病毒的番茄紅果材料‘T2015-47為對(duì)照，以gf位點(diǎn)特異引物進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，‘T2016-33不能酶切出109 bp和57 bp的特異條帶，為gf基因突變體；‘2012-2酶切出187 bp和171 bp的特異條帶，為gf²基因突變體；‘T2015-66和‘T2016-32酶切出216 bp和18 bp的特異條帶，為gf⁴基因突變體。建立了利用分子標(biāo)記快速準(zhǔn)確鑒定出棕果番茄是否為gf位點(diǎn)突變體的方法，為選育抗褪綠病毒的棕果番茄品種提供了輔助手段。

關(guān)鍵詞：棕果番茄；gf位點(diǎn)；基因標(biāo)記

在許多植物的果實(shí)成熟和葉片衰老過程中，葉綠素不降解或降解不完全導(dǎo)致其出現(xiàn)滯綠現(xiàn)象，發(fā)生的個(gè)體為滯綠突變體。到目前為止，在擬南芥、玉米、煙草、高粱等諸多植物中都發(fā)現(xiàn)了滯綠突變體。Thomas和Howarth根據(jù)衰老時(shí)葉綠素含量和光合能力將滯綠突變體分為了5類。目前，人們對(duì)番茄的需求不止于風(fēng)味，更重視它所起到的保健功能，紫果或棕果番茄具有獨(dú)特的外觀，富含強(qiáng)抗氧化能力的花青苷，營養(yǎng)價(jià)值較高，受到人們的極大關(guān)注婀。但是研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有的紫果或棕果番茄均富含花青苷，有些紫果或棕果番茄屬于C型非功能型綠果肉突變體，這種類型的番茄在果實(shí)轉(zhuǎn)紅期間葉綠素并不完全消失，而且番茄紅素逐漸積累，也會(huì)使果實(shí)呈現(xiàn)棕色至紫黑色等不同程度顏色的變化。雖然同自然生長的紫果或棕果番茄相比，番茄綠果肉突變體中花青苷含量低，但它的出現(xiàn)為番茄植株葉片衰老的機(jī)制研究、果實(shí)成熟以及基因功能研究提供了新的思路。同時(shí)，番茄綠果肉突變體在粉虱入侵后對(duì)病毒的抗病性方面也表現(xiàn)較好，對(duì)生產(chǎn)的意義巨大。

近年來，越來越多的人開始利用分子生物學(xué)的方法對(duì)滯綠突變體進(jìn)行研究。番茄gf位點(diǎn)突變體，也就是番茄綠果肉突變體，最早在1955年被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該突變體是由第八染色體上的單個(gè)隱性基因SGR（即GF基因）控制的，該基因位于CT265和CT148之間0.44 cM區(qū)域。為了確定該基因的變化，HU等克隆了番茄gf位點(diǎn)突變體和野生番茄中的LeSGR1基因，進(jìn)行DNA序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在番茄gf位點(diǎn)突變體中發(fā)生了單核苷酸替換，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了變化。Barry等發(fā)現(xiàn)gf位點(diǎn)有g(shù)f、gf²、gf³、gf⁴、gf⁵共5種等位基因，并且開發(fā)了檢測(cè)gf、gf²、gf⁵突變體的標(biāo)記。肖良軍等用RT-PCR法擴(kuò)增到gf突變體中的cDNA序列，將其與紅色番茄GF基因的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，設(shè)計(jì)出檢測(cè)gf³、gf⁴突變體的dCAPS標(biāo)記。筆者綜合了上述分子標(biāo)記的方法對(duì)6種棕果番茄材料進(jìn)行檢測(cè)，以確定試驗(yàn)材料是否為gf位點(diǎn)突變體及所屬突變體類型，為后續(xù)番茄材料的抗病育種以及相應(yīng)SGR基因研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料7份番茄材料由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)程斐老師提供，從300份候選材料中篩選而來，其中‘T2015-65‘T2015-66‘2012-2‘2012-3‘T2016-33‘T2016-32為棕果番茄，編號(hào)1～6，以‘T2015-47紅果番茄為對(duì)照。所有番茄均于2015年5月中旬播種于72孔穴盤中，待幼苗長至3葉1心時(shí)移栽至即墨試驗(yàn)基地，常規(guī)管理。

1.1.2試劑及引物設(shè)計(jì) 特異性引物參考Barry等和肖良軍等的設(shè)計(jì)，由青島擎科梓熙生物有限公司合成。各引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。酶切所需限制性內(nèi)切酶Hpy188I酶由NEB公司提供，限制性內(nèi)切酶MseI酶、DdeI酶由Takara生物科技有限公司提供。其他用于PCR反應(yīng)和凝膠電泳的試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 取番茄新鮮幼嫩葉片，采用北京天根生物科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒提取番茄基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增和酶切PCR反應(yīng)總體系為20μL：模板DNA 20 ng，2.5 mmol·L^-1dNTP 0.4μL，上下游引物（10 mol·L^-1）各1.0μL，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×Buffer 2.0μL，20 mmol·LMg²⁺2.0μL，ddH2O補(bǔ)齊至20μL。

用表1中引物對(duì)gfallele-f/gfallele-r對(duì)番茄基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hpy188I于37℃下酶切1 h，可檢測(cè)是否為gf突變體；利用引物對(duì)gf²caps-f/gf²caps-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MseI于60℃下酶切1 h，可檢測(cè)是否為gf²突變體；用引物對(duì)dCAPS-F/dCAPS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DdeI于37℃下酶切1 h，可檢測(cè)是否為gf³或gf⁴突變體；用引物對(duì)U316068F/U316068R進(jìn)行PCR擴(kuò)增可檢測(cè)是否為gf⁵突變體。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火（gfallele-f/gfallele-r 60℃、gf²caps-f/gf² caps-r 58℃、dCAPS-F/dCAPS-R 50℃、U316068F/U316068R54℃）1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，酶切片段用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1番茄基因組DNA電泳檢測(cè)

在紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)基因組DNA的OD2MOD=o值，比值均在1.9左右，純度較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。同時(shí)，用瓊脂糖電泳檢測(cè)的DNA條帶清晰，無降解彌散現(xiàn)象（圖1），質(zhì)量較好。

2.2棕果番茄材料gf基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

用特異性引物gfallele-f/gfallele-r對(duì)番茄基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有材料均能擴(kuò)增出166 bp的條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hpy188I酶切后，在8%聚丙烯酰胺凝膠電泳下檢測(cè)，gf突變體番茄的PCR產(chǎn)物不能被酶切，其他的均能被酶切為109 bp和57 bp的條帶。結(jié)果顯示，1～4、6號(hào)番茄材料同對(duì)照一樣，都能被酶切為2條帶，只有5號(hào)不能被酶切，即番茄材料‘T2016-33為gf基因突變體。

2.3棕果番茄材料gf²基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

用特異性引物gf²caps-f/gf²caps-r對(duì)番茄基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有材料均能擴(kuò)增出358 bp的條帶（圖3）。經(jīng)限制性內(nèi)切酶MseI酶切后，gf²。突變體番茄的PCR產(chǎn)物被酶切為187 bp和171 bp的片段，其他的不能被酶切。結(jié)果顯示，1、2、4～6號(hào)條帶與對(duì)照相同，沒有被酶切，3號(hào)被酶切為2條帶，即番茄材料‘2012-2為gf²基因突變體。

2.4棕果番茄材料gf³和gf⁴基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

用特異性引物dCAPS-F/dCAPS-R對(duì)番茄基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有材料均能擴(kuò)增出231 bp的條帶（圖4）。PCR產(chǎn)物在限制性內(nèi)切酶DdeI酶切后，若為gf⁴突變體，PCR產(chǎn)物則被酶切為216 bp和18 bp的片段，若為gf³突變體，被酶切為小于200 bp的片段，其他的不能被酶切。結(jié)果顯示，2、6號(hào)被酶切為216 bp和18 bp片段（18 bp片段較小，圖中未顯示），而未有小于200 bp的條帶，其他材料與對(duì)照相同均未被酶切，所以‘T2015-66和‘T2016-32為fg⁴突變體。

2.5棕果番茄材料gf⁵基因的分子標(biāo)記檢測(cè)

用特異性引物對(duì)U316068F/U316068F在紅果番茄中可擴(kuò)增到2 550 bp左右的片段。經(jīng)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，gf⁵突變體在核苷酸的1 262～2 425 bp之間有1 163 bp的缺失，若為gf⁵基因突變體，則PCR擴(kuò)增后只有1 400 bp左右的片段。結(jié)果顯示，6份番茄材料擴(kuò)增結(jié)果與對(duì)照相同，均能擴(kuò)增到2 550 bp的片段，未有1 400 bp的條帶，說明無gf⁵突變體。

綜合以上結(jié)果，對(duì)7個(gè)試驗(yàn)材料的基因型和等位基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表2所示。

3討論

番茄果實(shí)成熟時(shí)色澤由綠轉(zhuǎn)紅是由色素種類和含量變化所致，主要是由于葉綠素含量下降和類胡蘿卜素含量升高。番茄中有很多自然突變體，在果實(shí)成熟時(shí)，諸多的番茄綠果肉突變體中，無論是gf突變體中單核苷酸的替換，gf²突變體中單核苷酸的插入，gf³和gf⁵突變體中核苷酸的缺失，還是gf⁴提前形成終止密碼子，都會(huì)保留相當(dāng)數(shù)量的葉綠素，使其呈現(xiàn)鐵銹色至紫黑色不同程度的顏色。Barry等在26份棕果、紫果或黑果番茄材料中檢測(cè)到了數(shù)量不等的5種gf位點(diǎn)突變體，肖良軍等從8份棕果材料中檢測(cè)到了1個(gè)gf、3個(gè)gf²、4個(gè)gf⁴突變體，但未發(fā)現(xiàn)gf³和gf⁵突變體。本試驗(yàn)利用Barry等和肖良軍等設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記對(duì)6份棕果番茄材料分別進(jìn)行了分子檢測(cè)，結(jié)果顯示在4份棕果番茄中檢測(cè)到了1個(gè)gf、1個(gè)gf²、2個(gè)gf⁴突變體，但未檢測(cè)到gf³和gf⁵突變體，是由于試驗(yàn)材料較少，今后應(yīng)該進(jìn)一步收集資源。在其他2份棕果番茄中未檢測(cè)出突變體，說明‘T2015-65和‘2012-3為富含花青苷的正常棕果番茄。

筆者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，番茄綠果肉突變體在番茄褪綠病毒侵染后，與其他番茄植株相比，黃化葉片極少，整株黃化程度較低，針對(duì)番茄褪綠病毒表現(xiàn)出良好抗性。但國內(nèi)外對(duì)gf位點(diǎn)突變體抗或耐番茄褪綠病毒機(jī)制的研究不多。本試驗(yàn)結(jié)果為番茄抗褪綠病毒病品種選育中有效跟蹤和利用gf位點(diǎn)突變體奠定了基礎(chǔ)，今后將從生理生化和遺傳方面對(duì)gf位點(diǎn)基因突變體與抗番茄褪綠病毒的關(guān)系進(jìn)一步深入研究，為育種工作提供理論依據(jù)。