泛素化修飾與細(xì)胞自噬

崔鈺晗，宋 迪，劉 月，關(guān)宇鶴，陳蒙蒙，陳 凡，王 潔，楊 波

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

自噬主要是指細(xì)胞吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，通過(guò)溶酶體進(jìn)行降解的過(guò)程。在生理情況下，自噬對(duì)于細(xì)胞存活、分化、發(fā)育以及穩(wěn)態(tài)的維持均至關(guān)重要。泛素化修飾在自噬調(diào)控方面起著重要作用。自噬的相關(guān)分子蛋白Unc-51樣自噬激活激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)、自噬相關(guān)基因6同源物(autophagy related 6 homolog，ATG6)Beclin-1等存在泛素化修飾，因此，尋找其調(diào)控分子及泛素化修飾位點(diǎn)，對(duì)于探討自噬的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

1 自噬

自噬主要是通過(guò)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)包裹部分細(xì)胞質(zhì)和需要降解的受損細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬-溶酶體，通過(guò)溶酶體內(nèi)部的各種水解酶降解其所包裹的內(nèi)容物，從而清除損傷的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，降解產(chǎn)物作為細(xì)胞再生與修復(fù)的原料，以實(shí)現(xiàn)廢物利用[1]。自噬作為一種機(jī)體防御和應(yīng)激的調(diào)節(jié)機(jī)制，參與一系列生理和病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，如果無(wú)適當(dāng)?shù)恼{(diào)控，自噬會(huì)導(dǎo)致各種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病、炎癥性疾病以及神經(jīng)退行性病變等[2]。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)成分進(jìn)入溶酶體方式的不同，自噬主要分為3種類型：大自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自體吞噬[3]。大自噬所能降解的蛋白種類最為廣泛，本文介紹的自噬主要是指大自噬。

自噬的發(fā)生起始于自噬小體形成，自噬小體形成又依賴于一系列自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related gene，ATG)的參與[4]。迄今為止，在酵母中已發(fā)現(xiàn)40余種ATG家族成員，大多數(shù)在人體內(nèi)具有同源物[5]。然而，只有不到50%的ATG蛋白對(duì)于經(jīng)典自噬小體的形成是必要的，包括ATG 1～10、12～14、16～18、29和31[6]。在經(jīng)典的自噬信號(hào)通路中，有2種類泛素的結(jié)合系統(tǒng)：ATG12耦合系統(tǒng)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，MAP-LC3)/ATG8脂聯(lián)系統(tǒng)，這2套系統(tǒng)均需要同一個(gè)泛素激活酶E1 (ubiquitin-activating enzyme，E1)ATG7的參與[7]。在ATG12耦合系統(tǒng)中，ATG7促進(jìn)ATG12-ATG5復(fù)合物的形成[8]；在LC3脂聯(lián)系統(tǒng)中，ATG7促進(jìn)LC3-I形成LC3-磷脂酰乙醇胺復(fù)合物，也被稱為L(zhǎng)C3-Ⅱ，是目前最廣泛使用的自噬標(biāo)志物[9]。目前研究表明，細(xì)胞自噬在組織穩(wěn)態(tài)、人類疾病(如腫瘤、神經(jīng)退行性病變、感染等)、免疫和衰老中發(fā)揮了舉足輕重的作用[10]。

2 泛素化修飾

76個(gè)氨基酸組成的泛素分子是具有高度保守性的小分子蛋白質(zhì)，在真核生物細(xì)胞中分布廣泛。在酶的介導(dǎo)下，泛素分子與蛋白質(zhì)結(jié)合，使靶蛋白被26S蛋白酶體識(shí)別并降解。泛素化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，泛素化修飾在多種酶的參與下完成。參與泛素化修飾的酶主要包括泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3，其中，泛素激活酶E1和泛素結(jié)合酶E2特異性較差，靶蛋白的選擇主要是由泛素連接酶E3決定[11]。泛素化修飾主要分為3個(gè)步驟進(jìn)行：第 1 步，在三磷腺苷水解提供能量的情況下，泛素激活酶E1與泛素分子C末端的半胱氨酸殘基結(jié)合，激活泛素分子；第2步，泛素激活酶E1將活化的泛素分子轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2上；第3步，泛素連接酶E3將泛素結(jié)合酶E2上的泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，完成泛素化修飾[12]。

泛素化修飾根據(jù)泛素分子的連接方式可以分為單泛素化修飾和多聚泛素化。只有1個(gè)泛素分子連接在靶蛋白的賴氨酸殘基上稱為單泛素化；而多個(gè)泛素分子結(jié)合形成鏈狀連接在靶蛋白的賴氨酸殘基上稱為多聚泛素化。目前，單泛素化修飾報(bào)道較少，關(guān)于泛素化修飾的研究主要集中在多聚泛素化修飾上，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位連接修飾[13]，其中對(duì)K48和K63位多聚泛素化研究最為廣泛。K48位多聚泛素化修飾主要促進(jìn)靶蛋白通過(guò)蛋白酶體發(fā)生降解，K63位多聚泛素化修飾則調(diào)節(jié)靶蛋白功能。泛素化修飾在許多生理功能中發(fā)揮作用，已經(jīng)成為現(xiàn)階段新的研究熱點(diǎn)。

3 自噬過(guò)程中的泛素化修飾

近年來(lái)，有關(guān)ATG蛋白翻譯后修飾的研究越來(lái)越多，比較常見(jiàn)的包括磷酸化、糖基化、泛素化及乙?；萚14]，目前研究最多最為透徹的是磷酸化修飾。自噬關(guān)鍵分子ULK1、Beclin-1等存在泛素化修飾，并影響自噬的形成，提示泛素化修飾在自噬的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。

3.1ULK1在酵母中，細(xì)胞自噬的形成需要多達(dá)40個(gè)分子的參與，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中需要更多。細(xì)胞自噬通過(guò)ULKl復(fù)合物得以啟動(dòng)。ULK1是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶，是重要的人類細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白之一，位于人類12號(hào)染色體的q24.3。ULK1是由人ULK1基因編碼的酶，其在酵母中的同源分子是ATG1[15]。酵母中ULK復(fù)合物含有ATG1和ATG13等組分，而哺乳動(dòng)物中的ULK復(fù)合物除了ULK1、ULK2和ATG13，還包含ATG101和局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)家族相互作用蛋白200(FAK-family interacting protein of 200，F(xiàn)IP200)等蛋白質(zhì)[16]。哺乳動(dòng)物基因組中ULK1同源家族成員很多，包括ULK1、ULK2、ULK3、ULK4和STK36[17]，這些蛋白都包含一個(gè)保守的N端結(jié)構(gòu)域。目前已知ULKl和ULK2在細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中同時(shí)敲除ULKl和ULK2可以顯著抑制依賴于營(yíng)養(yǎng)的細(xì)胞自噬[18]。在ULK1復(fù)合物中，ULK1通過(guò)其C末端直接與FIP200結(jié)合，而ATG13則能夠增強(qiáng)ULK1和FIP200的結(jié)合[19]。FIP200與ATG13共同調(diào)節(jié)了ULK1在自噬過(guò)程中的激酶活性。ULK1-ATG13-FIP200復(fù)合物的形成不會(huì)因營(yíng)養(yǎng)條件的變化而改變，而在營(yíng)養(yǎng)富足狀態(tài)下，哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白1與ULK1復(fù)合物相互作用，下調(diào)ULK1復(fù)合物的活性，自噬發(fā)生被抑制。西羅莫司誘導(dǎo)或者饑餓狀態(tài)下，哺乳動(dòng)物西羅莫司靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex-1，mTORC1)與ULK1復(fù)合物解離，使ULK1的活性得以恢復(fù)，促進(jìn)自噬形成[20]。

K63泛素鏈在自噬形成過(guò)程中具有重要作用。有研究表明，Beclin-1調(diào)控自噬激活分子(activating molecule in Beclin-1 regulated autophagy，AMBRA1)通過(guò)與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumour necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)相互作用，促進(jìn)ULK1的K63位連接的泛素化修飾，進(jìn)而提高其穩(wěn)定性，促進(jìn)自噬的發(fā)生[21]。TRAF6過(guò)表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)本底和饑餓誘導(dǎo)條件下自噬形成增多；然而，將AMBRA1敲低以后，TRAF6過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)自噬的能力有所降低，表明TRAF6誘導(dǎo)自噬可能依賴于AMBRA1[22]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6與AMBRA1和ULK1存在明顯的共定位，當(dāng)下調(diào)AMBRA1表達(dá)時(shí)，TRAF6與ULK1相互作用的能力受到影響，說(shuō)明AMBRA1對(duì)于TRAF6-ULK1的泛素化修飾在它們誘導(dǎo)自噬的過(guò)程中具有重要作用[23]。

LEE等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Cul3-KLHL20泛素連接酶可以通過(guò)泛素化修飾促進(jìn)ULK1降解來(lái)終結(jié)自噬的發(fā)生，而Kelch樣蛋白20(Kelch-like protein 20，KLHL20)基因敲除增加了ULK1的蛋白穩(wěn)定性。此外，在Roc1-Cul3-KLHL20復(fù)合物存在下，ULK1在體外系統(tǒng)中發(fā)生了泛素化修飾，這些結(jié)果提示，ULK1很可能是E3連接酶KLHL20的直接底物。KLHL20過(guò)度表達(dá)下調(diào)了ULK1的蛋白水平，并且，在KLHL20的Cul3結(jié)合缺陷型突變體中未觀察到這種現(xiàn)象，提示KLHL20功能的發(fā)揮依賴于和Cul3的結(jié)合。KLHL20誘導(dǎo)的ULK1表達(dá)下調(diào)可以被蛋白酶體抑制劑MG132恢復(fù)，說(shuō)明KLHL20依賴性ULK1降解是通過(guò)蛋白酶體途徑的。ALEMU等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在饑餓環(huán)境下，ULK1蛋白水平逐漸下降，并且隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，ULK1 K48位泛素化修飾程度增加，這與LEE等[24]的研究相吻合。因此，KLHL20介導(dǎo)饑餓誘導(dǎo)的ULK1泛素化修飾和降解有助于自噬的終止[26]。

3.2Beclin-1Beclin-1是酵母中ATG6/空泡蛋白分選30(vacuolar protein-sorting 30，VPS30)的同源基因，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞參與自噬的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子。研究表明，Beclin-1不僅參與自噬體的形成，還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[27]。在自噬發(fā)生過(guò)程中，自噬與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復(fù)制的調(diào)控密切相關(guān)。HBV X蛋白是HBV生物學(xué)過(guò)程中的一種多功能調(diào)節(jié)因子，其對(duì)HBV自噬誘導(dǎo)至關(guān)重要，HBV X蛋白通過(guò)上調(diào)Beclin-1蛋白表達(dá)而增加自噬體的形成[28]；神經(jīng)元前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)4(neuronal precursor cell expressed developmentally downregulation 4，NEDD4)在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，NEDD4通過(guò)與Beclin-1相互作用來(lái)抑制結(jié)核分枝桿菌和李斯特菌的復(fù)制，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生[29]。另外，抗凋亡蛋白Bcl-2在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過(guò)抑制Beclin-1的功能而削弱饑餓誘導(dǎo)的自噬體的發(fā)生[30]。在自噬發(fā)生過(guò)程中，Beclin-1蛋白存在多種翻譯后修飾，包括泛素化修飾，但泛素化修飾精確調(diào)節(jié)Beclin-1的機(jī)制仍然報(bào)道不多。

鋅指蛋白216 (ring finger protein 216，RNF216)是一種泛素連接酶，能夠強(qiáng)烈抑制巨噬細(xì)胞中的自噬。RNF216能夠與Beclin-1相互作用，促進(jìn)Beclin-1的K48位連接的泛素化修飾。在肺泡巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)RNF216可抑制自噬的發(fā)生，而敲低RNF216可顯著抑制這些結(jié)果[31]。泛素連接酶NEDD4能促進(jìn)Beclin-1的賴氨酸第11位(lysine-11，K11)連接的泛素化修飾，影響B(tài)eclin-1的穩(wěn)定性。而VPS34敲除以后，NEDD4介導(dǎo)的Beclin-1 K11位連接的泛素化修飾增強(qiáng)，導(dǎo)致其蛋白酶體降解增加，從而抑制自噬的發(fā)生[32]。因此，NEDD4和RNF216對(duì)Beclin-1進(jìn)行K11和K48位泛素化修飾，導(dǎo)致其降解并抑制自噬的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1蛋白K437位點(diǎn)可以發(fā)生K11連接的泛素化修飾，對(duì)其蛋白穩(wěn)定性是必需的；然而，抑制K437位點(diǎn)的K11連接的泛素化修飾能夠抑制Beclin-1的降解，促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生[33]。而去泛素化酶泛素特異性蛋白酶19能夠?qū)437位的K11泛素鏈降解，通過(guò)增強(qiáng)Beclin-1蛋白穩(wěn)定性而促進(jìn)自噬的發(fā)生[34]。

研究表明，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞發(fā)生自噬的過(guò)程中，E3連接酶AMBRA1 能夠使Beclin-1發(fā)生K63位的泛素化修飾，從而增強(qiáng)VPS34活性；而Wiskott-Aldrich綜合征蛋白通過(guò)與Beclin-1相互作用來(lái)抑制Beclin-1泛素化修飾，以滅活VPS34活性，從而抑制自噬[35]，說(shuō)明Beclin-1-VPS34復(fù)合物中Beclin-1的泛素化修飾不僅影響其自身功能，也能影響其“伙伴”的功能。在Toll樣受體4誘導(dǎo)的自噬過(guò)程中，TRAF6介導(dǎo)的Beclin-1 K63位泛素化修飾至關(guān)重要；而去泛素化酶腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3則通過(guò)減少Beclin-1 K63位泛素化修飾，從而抑制Toll樣受體信號(hào)誘導(dǎo)的自噬。此外，用白細(xì)胞介素-1或干擾素刺激Raw 264.7細(xì)胞，或饑餓處理其他細(xì)胞，均能夠增強(qiáng)Beclin-1 K63位連接的泛素化修飾，促進(jìn)自噬體的形成。這些結(jié)果表明了Beclin-1 K63位泛素化修飾在自噬的形成中具有重要的作用。

3.3其他分子VPS34是Ⅲ類磷脂酰肌醇激酶復(fù)合物中的催化亞單位，在自噬中起著重要的調(diào)節(jié)作用。它由催化亞基VPS34和調(diào)節(jié)亞基VPS15組成，能夠催化磷脂酰肌醇生成磷脂酰肌醇3-磷酸[36]。F盒富含亮氨酸的重復(fù)蛋白20(F-box and leucine-rich repeat protein 20，F(xiàn)BXL20)是一種F盒蛋白，與CUL1、S段激酶相關(guān)蛋白1(S-phase kinase-associated protein-1，SKP1)形成SKP1-CUL1-F盒蛋白質(zhì)(SKP1-CUL1-F-box protein，SCF)復(fù)合物共同行使泛素連接酶功能。然而，細(xì)胞外信號(hào)是如何調(diào)節(jié)VPS34復(fù)合物及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的，目前尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在DNA損傷條件下，p53的激活能增加FBXL20轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)SCF復(fù)合物對(duì)VPS34的泛素化修飾，導(dǎo)致其降解，最終抑制自噬[36]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DNA損傷導(dǎo)致有絲分裂停滯及CDK的活化，進(jìn)而使VPS34發(fā)生磷酸化修飾，而泛素連接酶E3識(shí)別磷酸化的VPS34，使其發(fā)生泛素化修飾而被蛋白酶體識(shí)別、降解[37]。

mTORC1是自噬調(diào)控的上游分子，主要通過(guò)與ULK1復(fù)合物結(jié)合而抑制自噬的發(fā)生。由結(jié)節(jié)硬化復(fù)合物1(tuberous sclerosis 1，TSC1)與TSC2結(jié)合形成的TSC蛋白復(fù)合物具有GTP酶活性，是mTORC1的主要調(diào)控因子。有研究表明，活化的突觸前密度蛋白連接激酶能夠磷酸化TSC2，從而阻止TSC2與TSC1結(jié)合，抑制TSC復(fù)合物的形成，解除對(duì)mTORC1活性的抑制[38]。另外，RNF家族的一些成員通過(guò)K63位泛素鏈修飾而調(diào)節(jié)mTORC1的功能，如泛素連接酶RNF152 激活 mTORC1[39]。

ATG12不僅是一種自噬相關(guān)蛋白，其本身還是一種泛素樣蛋白，能夠直接被泛素化修飾，通過(guò)蛋白酶體降解而抑制自噬的發(fā)生。同時(shí)，ATG12、ATG5和ATG16L結(jié)合形成的復(fù)合物能夠發(fā)揮類泛素連接酶活性，參與LC3脂化過(guò)程，對(duì)自噬的形成是必需的。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，自噬已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，越來(lái)越多的研究者關(guān)注泛素化修飾在自噬發(fā)生過(guò)程中的調(diào)節(jié)功能。ATG蛋白參與自噬形成的各個(gè)階段，機(jī)體通過(guò)對(duì)ATG蛋白進(jìn)行泛素化修飾來(lái)調(diào)控自噬的發(fā)生與終結(jié)。目前，關(guān)于ATG蛋白泛素化修飾的研究主要集中在Beclin-1和ULK1，其他參與自噬形成的ATG蛋白則鮮有報(bào)道。對(duì)于這些分子的泛素化修飾的研究，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)自噬發(fā)生及其終結(jié)的具體機(jī)制，為臨床治療自噬相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)及可能的治療靶點(diǎn)。