溝紋硬皮地蛛粗毒的多肽成分初探

唐 興, 陳連水, 黃亞洲, 段志貴, 劉中華, 梁宋平

(1.東華理工大學(xué)江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330013；2.湖南師范大學(xué)動(dòng)物多肽藥物國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410081)

作為最有毒的動(dòng)物之一，蜘蛛通過自身毒液殺死獵物或防御天敵.蜘蛛毒液是復(fù)雜的化學(xué)混合物，其中成分包括低分子質(zhì)量有機(jī)成分(<1 ku)，線性細(xì)胞溶解肽和富含二硫鍵的神經(jīng)毒素多肽(1～9 ku)、蛋白質(zhì)和酶(>10 ku)[1].其中，神經(jīng)毒素多肽在蜘蛛毒液中含量最高，其研究報(bào)道也最多.蜘蛛神經(jīng)毒素多肽的主要靶標(biāo)是各種離子通道，它們是存在于神經(jīng)元和肌細(xì)胞的電興奮細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)成分.這些離子通道包括各種不同的電壓門控離子通道(鉀、鈉、鈣)，還有化學(xué)性、熱學(xué)性、機(jī)械敏感性的離子通道[2-4].蜘蛛毒液中也含有一些線性細(xì)胞溶解肽，它們主要分離于狼蛛總科蜘蛛的毒液，能夠殺滅各種細(xì)菌、真菌、寄生蟲、昆蟲等[4-6].

中國蜘蛛資源豐富，有記載的超過3600種.在我國蜘蛛毒液研究中，涉及種類最多的是捕鳥蛛科蜘蛛，如虎紋捕鳥蛛、敬釗纓毛捕鳥蛛、海南捕鳥蛛等[7-9]，因?yàn)槠鋫€(gè)體大和毒液分泌量較多被廣泛研究；其次如穴居狼蛛、黑寡婦蜘蛛、雷氏大疣蛛[10,11]，因其毒性較高也被研究者關(guān)注.但是大多數(shù)蜘蛛體型較小，或其毒液分泌量較少，研究開展困難，因此未進(jìn)行毒素研究的蜘蛛種類占絕大多數(shù).

地蛛科隸屬蜘蛛目原蛛下目，是穴居地下生活的蜘蛛類群，在我國已發(fā)現(xiàn)的種類有43種.它們可以分為3個(gè)屬：Atypus(29種)、Calommata(7種)、Sphodros(7種).溝紋硬皮地蛛最早在日本發(fā)現(xiàn)，在我國一些地區(qū)也有分布，它是農(nóng)林業(yè)重要的害蟲天敵，具有一定保護(hù)意義.其顯著體征是頭胸部呈淺橙色， 兩側(cè)邊緣逐漸呈深褐色.腹部呈褐色，腹部下方前方有一白斑.螯爪呈黑褐色，值得注意的是這對螯肢(連螯爪)在整個(gè)身體中占較大的比例.關(guān)于溝紋硬皮地蛛的結(jié)構(gòu)形態(tài)和農(nóng)業(yè)保護(hù)方面已有些研究[12-15]，但至今國內(nèi)外還未有對其毒液以及所含成分進(jìn)行過研究報(bào)道.

本次試驗(yàn)首次通過電刺激法采集溝紋硬皮地蛛毒液，然后進(jìn)行高效液相色譜分離，再對其所含多肽成分進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定.通過比較溝紋硬皮地蛛毒素多肽成分的分子質(zhì)量特征與已報(bào)道蜘蛛的異同點(diǎn)，揭示該種蜘蛛毒液成分的特異性.

1 材料與方法

1.1 溝紋硬皮地蛛采集與粗毒的制備

圖1 溝紋硬皮地蛛Fig.1 Calommata signatum

雌性溝紋硬皮地蛛(圖1)采集于貴州省山區(qū)的土壤穴洞，然后在實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng).溝紋硬皮地蛛毒液通過電刺激器采集(參數(shù)為中等強(qiáng)度頻率，20 V電壓強(qiáng)度).毒液冷凍干燥后即為粗毒，-20 ℃保存.

1.2 溝紋硬皮地蛛粗毒的分離純化

精確稱取溝紋硬皮地蛛粗毒1.0 mg，用0.5 mL雙蒸水溶解，高速離心后取上清液即為樣品溶液.分離使用Alliance高效液相色譜儀(Waters)，色譜柱采用Phenomenex C18反相柱(250 mm×4.6 mm)，分離過程采用兩相洗脫系統(tǒng).流動(dòng)相：A液為含0.1%三氟乙酸(體積分?jǐn)?shù))的雙蒸水；B液為含0.1%三氟乙酸(體積分?jǐn)?shù))的乙腈.A、B液都通過加入惰性氣體除去溶液中氣泡.先用A液脫鹽15 min，然后再用B液進(jìn)行洗脫.洗脫流速為1.0 mL·min-1，其監(jiān)測的波長為215和280 nm，洗脫時(shí)柱溫為25 ℃.其洗脫梯度為：0～10 min，5～15 B%；10～45 min，15～40 B%；45～50 min，40～100 B%.根據(jù)洗脫時(shí)間收集各洗脫峰，并冷凍干燥后保存.

1.3 質(zhì)譜鑒定

通過德國MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀(UltraFlex I, Bruker Daltonics)進(jìn)行多肽分子質(zhì)量的鑒定，儀器設(shè)定為線性工作模式.配制含有0.1%三氟乙酸和50%乙腈的飽和 α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液，超聲后高速離心5～10 min，取上清溶液作為基質(zhì)溶液.

溝紋硬皮地蛛粗毒溶液取1 μL，并用雙蒸水稀釋50倍，然后取0.5 μL與基質(zhì)按1∶1的比例混合后點(diǎn)樣.將干燥后的洗脫成分用2 μL雙蒸水溶解，再各取1 μL與基質(zhì)溶液按1∶1的比例混合后點(diǎn)樣于金屬靶盤上，在室溫下風(fēng)干10 min后進(jìn)行分子質(zhì)量鑒定.

2 結(jié)果與分析

2.1 粗毒的色譜分離

通過C18反向色譜柱對溝紋硬皮地蛛粗毒進(jìn)行分離，在波長280和215 nm下均有檢測(圖2A和2B).結(jié)果顯示，同一次分離過程中，在波長215 nm檢測明顯比波長280 nm檢測靈敏，分離效果較好，后者洗脫峰數(shù)量較多.因此，本試驗(yàn)在波長215 nm檢測下，根據(jù)不同洗脫時(shí)間共收集37個(gè)洗脫峰(圖2B).

2.2 質(zhì)譜鑒定

溝紋硬皮地蛛粗毒通過MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定后，圖3顯示了該粗毒的主要離子峰.分子質(zhì)量([M+H+])可分成兩個(gè)區(qū)域：較低分子質(zhì)量毒素多肽，分子質(zhì)量分別為1708.3和3543.0 u;較高分子質(zhì)量毒素多肽，分子質(zhì)量為6 445.3、7 771.7、7 878.4 u.

A.波長280 nm;B.波長215 nm.圖2 溝紋硬皮地蛛毒素多肽的反相色譜分離圖Fig.2 Reversed-phase HPLC profile of toxin peptides from C.signatum

圖3 溝紋硬皮地蛛粗毒的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of MALDI-TOF from C.signatum venom

通過MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜檢測洗脫峰的質(zhì)荷比，其中大部分洗脫峰可以鑒定到分子質(zhì)量結(jié)果(表1).絕大多數(shù)洗脫峰的質(zhì)譜圖譜中出現(xiàn)了兩個(gè)以上的的信號峰，主要信號峰一般明顯強(qiáng)于其他信號峰，說明該成分為此洗脫峰中的主要成分.另外，少數(shù)質(zhì)譜圖譜中僅含有1個(gè)信號峰，幾乎不存在其他信號峰，說明該洗脫峰所含成分純度很高；這些成分的洗脫時(shí)間和對應(yīng)的分子質(zhì)量([M+H+])分別為7 949.0(29.29 min)、2 226.8(29.59 min)、7 771.7(31.97 min)、7 293.1(34.01 min)、2 757.9 u(40.33 min).

但是，幾個(gè)洗脫面積較大的洗脫峰(洗脫時(shí)間分別為17.74、20.82、22.01、24.56、37.77 min)并無鑒定結(jié)果(圖2B).究其原因，可能是質(zhì)譜檢測時(shí)設(shè)置的質(zhì)荷比在1 000～10 000 u，而該蜘蛛粗毒中可能還含有一些小分子多胺類成分，因此無法在此分子質(zhì)量范圍檢測.

表1 溝紋硬皮地蛛毒素多肽的分子量列表1)Table 1 Molecular weight of toxin peptides from C.signatum

1)每個(gè)洗脫峰的質(zhì)譜圖譜中出現(xiàn)的最強(qiáng)信號峰用下劃線顯示；“—”表示未鑒定到結(jié)果.

2.3 分子質(zhì)量分布和頻率圖

圖4 溝紋硬皮地蛛粗毒的多肽分子質(zhì)量分布圖Fig.4 Molecular weight distribution of toxin peptides from C.signatum crude venom

本試驗(yàn)從溝紋硬皮地蛛粗毒中一共鑒定到105種不同分子質(zhì)量(去冗余)的毒素多肽組分.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果表明：分子質(zhì)量分布和頻率圖體現(xiàn)了溝紋硬皮地蛛毒素多肽的分布特征(圖4和5)，大多數(shù)多肽的分子質(zhì)量分布范圍在1 000～3 500 u(占總數(shù)84.8%)，還有一部分多肽的分子質(zhì)量分布在3 500～4 500 u(占總數(shù)4.7%)和6 500～8 500 u(占總數(shù)10.5%),但是毒素多肽在分子質(zhì)量分布范圍4 500～6 500 u和8 500～10 000 u內(nèi)沒有檢測到.另外，從反向色譜分離的洗脫時(shí)間來看，大多數(shù)毒素多肽在洗脫時(shí)間10～28 min被洗脫收集，且分子量幾乎全在小于4 000 u以下；而大于6 500 u以上的毒素多肽均出現(xiàn)在洗脫時(shí)間28min之后的洗脫峰中.

圖5 溝紋硬皮地蛛粗毒的多肽頻率柱狀圖Fig.5 Frequency histogram of toxin peptides from C.signatum crude venom

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)首先對溝紋硬皮地蛛粗毒進(jìn)行直接質(zhì)譜鑒定，然后利用反向高效液相色譜分離后，再通過質(zhì)譜對各洗脫成分進(jìn)行分子質(zhì)量鑒定.結(jié)果表明，未分離粗毒的直接質(zhì)譜鑒定，明顯只能獲得極少的多肽分子質(zhì)量信息.因?yàn)橥ǔχ┲氪侄镜闹苯淤|(zhì)譜檢測中，由于多肽成分較多，從而導(dǎo)致質(zhì)譜檢測時(shí)會(huì)產(chǎn)生離子抑制效果[16].另一方面，MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜采用的是線性工作模式，盡管在該模式下靈敏度比反射模式高得多，但是分子質(zhì)量較大的多肽分子(>4 000 u)更容易獲得離子峰.在粗毒的直接質(zhì)譜鑒定圖中，在低分子質(zhì)量分布范圍(<4 000 u)，僅1 708.3和3 543.0 u兩個(gè)明顯的離子峰；而反向高效液相色譜分離結(jié)合質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示，分子質(zhì)量小于4 000 u的多肽成分占該粗毒成分的絕大多數(shù).因此，對溝紋硬皮地蛛粗毒進(jìn)行反向高效液相色譜分離結(jié)合質(zhì)譜分析更能真實(shí)反映該蜘蛛粗毒中多肽成分的分子質(zhì)量特征(分布、豐度、數(shù)量、頻率等).

溝紋硬皮地蛛隸屬于原蛛下目蜘蛛，該下目蜘蛛還包括捕鳥蛛科、異紡蛛科、螲蟷科、漏斗網(wǎng)科的蜘蛛(http://www.wsc.nmbe.ch/).其中，捕鳥蛛科蜘蛛毒液研究較多，其毒素多肽分子量分布范圍1 000～9 000 u，其主要分子質(zhì)量范圍分布在3 500～4 500 u[17]，一般含有3～5對二硫鍵，肽鏈長度多為30～45個(gè)氨基酸殘基.這些毒素多肽分子的功能主要是作用于昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的各種離子通道.溝紋硬皮地蛛毒素多肽的分子質(zhì)量分布范圍在1 000～8 500 u，這與捕鳥蛛科蜘蛛多肽分子質(zhì)量分布范圍基本吻合.但是明顯不同的是，溝紋硬皮地蛛毒素多肽的主要分子量范圍集中在1 000～3 500 u，可以推測其毒素多肽主要為小于30個(gè)氨基酸的短鏈多肽.而且，這種蜘蛛粗毒的毒素多肽成分在分子質(zhì)量4 500～6 500 u范圍發(fā)生缺失，這與捕鳥蛛科蜘蛛毒素多肽成分明顯不同.另外，溝紋硬皮地蛛毒素多肽成分與其他種類蜘蛛所含成分比較，其分子質(zhì)量分布特征也各不相同，說明地蛛科蜘蛛所含毒液成分具有該科的特有性質(zhì)[10,11,18,19].本試驗(yàn)是首次對溝紋硬皮地蛛毒液所含多肽成分的初探，鑒定了該蜘蛛毒素多肽成分分子質(zhì)量的大體分布情況，希望能對今后的進(jìn)一步研究(如測序、cDNA文庫構(gòu)建、多肽活性功能測定等)提供借鑒作用.

[1] WIGGER E, KUHN-NENTWIG L, NENTWIG W. The venom optimisation hypothesis: a spider injects large venom quantities only into difficult prey types[J]. Toxicon, 2002,40(6):749-752.

[2] PHILLIPS L R, MILESCU M, LI-SMERIN Y, et al. Voltage-sensor activation with a tarantula toxin as cargo[J]. Nature, 2005,436(7052):857-860.

[3] BOHLEN C J, PRIEL A, ZHOU S, et al. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain[J]. Cell, 2010,141(5):834-845.

[4] VASSILEVSKI A A, KOZLOV S A, GRISHIN E V. Molecular diversity of spider venom[J]. Biochemistry (Mosc), 2009,74(13):1 505-1 534.

[5] KUHN-NENTWIG L, WILLEMS J, SEEBECK T, et al. Cupiennin 1a exhibits a remarkably broad, non-stereospecific cytolytic activity on bacteria, protozoan parasites, insects, and human cancer cells[J]. Amino Acids, 2011,40(1):69-76.

[6] 唐興,陳連水,李江.蜘蛛抗菌肽研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),2014,26(10):1 090-1 095.

[7] TANG X, ZHANG Y Q, HU W J, et al. Molecular diversification of peptide toxins from the tarantula Haplopelma hainanum (Ornithoctonushainana) venom based on transcriptomic, peptidomic, and genomic analyses[J]. Proteome Res, 2010,9(5):2 550-2 564.

[8] LIAO Z, CAO J, LI S M, et al. Proteomic and peptidomic analysis of the venom from Chinese tarantulaChilobrachysjingzhao[J]. Proteomics, 2007,7:1 892-1 907.

[9] YUAN C H, JIN Q H, TANG X, et al. Proteomic and peptidomic characterization of the venom from the Chinese bird Spider,OrnithoctonushuwenaWang[J]. J Proteome Res, 2007,6(7):2 792-2 801.

[10] DUAN Z G, YAN X J, HE X Z, et al. Extraction and protein component analysis of venom from the dissected venom glands ofLatrodectustredecimguttatu[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2006,145(3-4):350-357.

[11] ZHANG Y Q, CHEN J J, TANG X, et al. Transcriptome analysis of the venom glands of the Chinese wolf spiderLycosasingoriensis[J]. Zoology (Jena), 2009,113(1):10-18.

[12] 汪耀文,朱傳典.陜西省三種蜘蛛記述[J].白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1986,8(6):44-45.

[13] 陳會(huì)明.貴州茂蘭喀斯特森林自然保護(hù)區(qū)的蜘蛛種類[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2003,22(2):127-135.

[14] 陳銀方,宋昌琪,劉林敏,等.中國茶園蜘蛛種類研究[J].茶葉科學(xué),2000,20(1):59-66.

[15] 王新國.陜南及關(guān)中地區(qū)蜘蛛資源研究[J].西安聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào).1999,2(2):19-24.

[16] ESCOUBAS P, SOLLOD B, KING G F. Venom landscapes: mining the complexity of spider venoms via a combined cDNA and mass spectrometric approach[J]. Toxicon, 2006,47(6):650-663.

[17] ESCOUBAS P, RASH L. Tarantulas: eight-legged pharmacists and combinatorial chemists[J]. Toxicon, 2004,43:555-574.

[18] DUAN Z G, CAO R, JIANG L P, et al. A combined de novo protein sequencing and cDNA library approach to the venomic analysis of Chinese spiderAraneusventricosus[J]. Journal of Proteomics, 2013,14(78):416-427.

[19] XU X X, WANG H Y, ZHANG F, et al. A comparative analysis of the venom gland transcriptomes of the fishing spidersDolomedesmizhoanusandDolomedessulfurous[J/OL]. PLoS One, 2015,10(10)[2015-10-07]http://trove.nla.gov.au/work/198217190?q&versionId=217020089.