遼寧沈陽甜椒曲葉病的病原鑒定

楊彩霞, 付晶晶, 韓 彤, 廖一鳴, 李 莉, 于美春

(沈陽大學生命科學與工程學院/遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點實驗室，遼寧 沈陽 110044)

植物桿狀病毒科(Virgaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)病毒是一類無包膜的大小為(300～310) nm×18 nm的桿狀病毒.基因組為一條長6.3～6.6 kb的正單鏈RNA，至少編碼4個蛋白，參與病毒的包裝、移動和復制，分別為衣殼蛋白(coat protein,CP)、 移動蛋白(movement protein,MP)和2個復制蛋白(replicase,Rep).自然條件下該屬病毒可通過汁液摩擦和種子傳染[1].目前，該屬病毒有25個確定種.其中，辣椒輕斑駁病毒(Peppermildmottlevirus，PMMoV)發(fā)生范圍最廣，在全球辣椒種植區(qū)均能發(fā)生和為害[2-8]；PMMoV還在土壤、加工食品、飲用水、污水和勞動工具上被檢測到，并且具有侵染活性[9-13].PMMoV的高致病性和強抗逆性是其在世界范圍內(nèi)廣泛分布的重要原因.依據(jù)PMMoV克服寄主L系列等位基因L1、L1a、L2、L3和L4介導的抗性能力，將其分為P0、P1、P1,2、P1,2,3和P1,2,3,45種致病型[14-15].目前，中國報道的PMMoV均屬于P1,2型，在北京、河北、寧夏、新疆、江西、貴州、湖南、福建、云南、湖北、四川、江蘇、廣西、山東和遼寧等地[16-23]被發(fā)現(xiàn)，給我國辣椒產(chǎn)業(yè)造成重大損失.本研究從遼寧省沈陽市表現(xiàn)嚴重曲葉癥狀的甜椒上分離到病菌，對其進行電鏡觀察和RT-PCR檢測，并對其致病性進行測定，以明確該病害的致病菌，為其防治提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 甜椒感染PMMoV的癥狀(A)和病毒粒子形態(tài)(B)Fig.1 Symptoms of the infected sweet pepper plants (A) and morphology of viral particle (B)

2015 年7月于遼寧省沈陽市大東區(qū)采集具有嚴重曲葉癥狀的甜椒葉片(圖1A)，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存.摩擦接種用的辣椒(Capsicumannuum)和心葉煙(Nicotianaglutinosa)種子由福建農(nóng)林大學植物病毒研究所吳祖建研究員惠贈.

1.2 方法

1.2.1 透射電鏡觀察 取具有典型曲葉癥狀的甜椒葉片置于研缽中，加少量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PB)，研磨至勻漿狀，6 000 r·min-1離心3 min.取上清，銅網(wǎng)置其中吸附1 min后，于2%磷鎢酸中染色10 s，置于透射電鏡(Hitachi TEM system)下觀察.

1.2.2 植物總RNA的提取及病毒的RT-PCR檢測 采用RNA Simple Total RNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]提取甜椒病葉總RNA，再利用TIANScript RT Kit[天根生化科技(北京)有限公司]反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA.具體操作：總RNA 3.0 μL, Oligo(dT)15(10 μmol·L-1) 2.0 μL，Super Pure dNTPs (2.5 mmol each) 2.0 μL，補RNase-Free ddH2O至14.5 μL后混勻，置70 ℃金屬浴加熱5 min，迅速在冰上冷卻2 min，短暫離心后加入TIANScript M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U·L-1) 1.0 μL、RNase抑制劑(20 U·μL-1) 0.5 μL、5×First-Strand Buffer 4.0 μL，混勻后置于42 ℃下50 min，90 ℃ 5 min終止反應(yīng)，置冰上冷卻后加入RNase-Free ddH2O至50.0 μL備用.

以上述cDNA作為模板，用Tobamovirus檢測通用引物TMV-mpf(AGTTGTTGATGAGTTCATGGA)/TMV-3nr(CAACCCTTCGATTTAAGTGGA)[24]進行PCR擴增(引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成).PCR反應(yīng)體系為25 μL，循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min.用1%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，目的片段經(jīng)TIANgel Midi Purification Kit[天根生化科技(北京)有限公司]回收和純化.將純化產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T[寶生物工程(大連)有限公司]于16 ℃金屬浴中連接1 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞DH5α菌株中，于37 ℃倒置培養(yǎng)過夜.挑取單菌落，于37 ℃、280 r·min-1搖床培養(yǎng)7 h，取2 μL菌液進行PCR鑒定.測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

1.2.3 序列分析 序列同源搜索利用NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫的BLAST程序(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)完成.同源性分析利用DNAStar的Clustal V程序完成.對于進化樹構(gòu)建，先利用Clustal_X version 1.83[25]進行完全聯(lián)配，再用軟件MEGA version 5.0[26]的最大似然法繪制，置信度設(shè)置為1 000，分支節(jié)點上的數(shù)值為后驗概率(>50%).用于序列同源性比較和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建的病毒序列信息見表1.

1.2.4 摩擦接種試驗 將RT-PCR檢測呈PMMoV陽性的辣椒植物作為毒源，采集1.0 g新鮮病葉，置于研缽中，經(jīng)0.1 mol·L-1PB研磨成勻漿狀后用紗布過濾得到初提病汁液.在辣椒和心葉煙健康植物葉片上撒少許金剛砂，蘸取病汁液單向摩擦葉片3次，接種植物放置0.5 h，用蒸餾水洗去葉片殘留物，置溫室中觀察葉片變化.試驗設(shè)3個重復，同時設(shè)陰性對照(健康植物只接種PB溶液，不接種病毒).所有植物置于26 ℃溫室中，每3 d觀察一次癥狀并記錄.

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒病葉的電鏡觀察結(jié)果

將新鮮辣椒病葉于透射電鏡下進行病毒粒子的負染色觀察，可見300 nm×18 nm的線性粒子，病毒粒子外表面無包膜(圖1B).病毒粒子形態(tài)特征顯示，該病毒應(yīng)為Tobamovirus成員，而健康植物葉片中沒有這種病毒粒子.

表1 PMMoV沈陽Pepsy分離物與其他報道的PMMoV分離物cp基因的核苷酸和氨基酸序列同源性1)Table 1 Percentage of nucleotide sequence identity and amino acid identity between cp gene of PMMoV isolate Pepsy of Liaoning and other published PMMoV

1)nt:核苷酸;aa:氨基酸.

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

M:DL2 000 DNA marker;1-9:辣椒病樣;10:健康辣椒;CK:水.圖2 PMMoV的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 RT-PCR detection of PMMoV

以甜椒病葉cDNA為模板，利用引物TMV-mpf/TMV-3nr進行PCR擴增，得到1條約770 bp的特異性片段，而健康辣椒中未檢測到該片段(圖2).測序結(jié)果顯示，該片段長度為769或771 nts(KX524520-KX5245202, KY234288-KY234293).Blast比對顯示該片段序列與PMMoV高度同源，同源性為94%～99%，包含474 nts的完整cp基因.

2.3 序列分析

PMMoV 9個沈陽分離物cp基因的核苷酸序列同源性和CP蛋白的氨基酸序列同源性均為98.3%～100.0%(表2)，可見它們屬同一個分離物，后續(xù)選取分離物Pepsy進行同源性分析.基于cp基因?qū)MMoV Pepsy分離物與GenBank中已報道的PMMoV各個分離物進行比對，核苷酸同源性為93.7%～99.8%，氨基酸同源性為96.8%～100.0%，其中與PMMoV北京分離物(PMMoV-[CN:BJ], AY859497)的同源性最高，均達100%(表1).系統(tǒng)進化樹表明，沈陽PMMoV 9個分離物與P1,2型 PMMoV聚在一個大分支上，而P1,2,3型和P1,2,3,4型聚在另一個分支上，TMV-[CN:FJ](AF395127)作為外群單獨聚在一個分支上(圖3).

表2 PMMoV沈陽9個分離物之間的CP同源性1)Table 2 Sequence identities based on the cp of 9 Shenyang isolates

1)nt:核苷酸;aa:氨基酸.

圖3 基于報道的PMMoV和PMMoV沈陽分離物cp基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic trees based on cp sequences of Shenyang isolates and other previously reported PMMoV

2.4 摩擦接種

接種6 d后，心葉煙的接種葉片出現(xiàn)了明顯的淺褐色局部壞死斑(圖4B)，但系統(tǒng)葉片上始終無癥狀出現(xiàn)(圖4C).辣椒的接種葉片在接種9 d后出現(xiàn)局部壞死斑(圖4I)，系統(tǒng)葉片在接種30 d后出現(xiàn)中度曲葉癥狀(圖4J).利用引物TMV-mpf/TMV-3nr檢測接種植物，發(fā)現(xiàn)心葉煙接種葉片中PMMoV呈陽性，系統(tǒng)葉片中PMMoV呈陰性(圖4G)；而在辣椒的接種葉片和系統(tǒng)葉片中PMMoV均呈陽性(圖4N).2組陰性對照始終未表現(xiàn)癥狀(圖4D-F，K-M)，且PMMoV檢測呈陰性(圖4G，N).上述結(jié)果表明，PMMoV僅可局部侵染心葉煙，根據(jù)斑點類型判斷其為P1,2致病型；但是可突破辣椒的防御系統(tǒng)實現(xiàn)系統(tǒng)侵染.

IL.接種葉片；SL.系統(tǒng)葉片.A-F.心葉煙接種PMMoV后的癥狀表現(xiàn)；H-M.辣椒接種PMMoV后的癥狀表現(xiàn).G和N分別為心葉煙和辣椒摩擦接種30 d后PMMoV的PCR檢測結(jié)果[M:DL2 000 DNA marker；1-6:健康植株接種PMMoV;7-8:健康植株接種PB緩沖液.其中，1、3、5和7為接種葉片；2、4、6和8為系統(tǒng)葉片.CK+:PMMoV侵染樣品；CK-:健康植株].圖4 PMMoV在心葉煙和辣椒上的致病性檢測Fig.4 Pathogenicity determination of PMMoV on N.glutinosa and C.annuum plants

3 討論

李曉冬等[23]發(fā)現(xiàn)遼寧省葫蘆島地區(qū)溫室大棚辣椒上暴發(fā)的病毒病與PMMoV有關(guān).2015年起，在沈陽大東區(qū)田間有20%甜椒表現(xiàn)嚴重的曲葉癥狀.經(jīng)電鏡觀察和分子檢測確定該病害的相關(guān)病毒為PMMoV；進化樹分析發(fā)現(xiàn)，PMMoV中國分離物均與P1,2型聚類，這與張強等[20]的分析結(jié)果一致.摩擦接種試驗顯示，PMMoV可傳播到健康的辣椒上，可系統(tǒng)侵染辣椒并誘導中度曲葉癥狀的發(fā)生，證明PMMoV與甜椒重型曲葉病相關(guān).但接種辣椒未見重型曲葉癥狀，可能有2種原因：(1)接種辣椒品種與自然發(fā)病的辣椒品種不同，接種癥狀受到辣椒基因型、接種時間以及接種溫度等因素的影響；(2)盡管電鏡觀察和RT-PCR檢測均未發(fā)現(xiàn)其他病毒的存在，但是不能完全排除這個可能性.例如，PMMoV在自然條件下可分別與屬內(nèi)的煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)和馬鈴薯Y病毒屬的辣椒斑駁病毒(Peppermottlevirus,PepMoV)復合侵染辣椒[21,27].本研究雖然未能完全驗證柯赫氏法則，但證明了PMMoV與重型甜椒曲葉病害相關(guān).由于PMMoV的致病性和存活能力較強，極易擴散蔓延，為避免其給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來威脅，有必要對這類病害進行防控.

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