非轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的獲得方法研究

張 杰 盧百亨

（1.寧波市海曙區(qū)集士港鎮(zhèn)農(nóng)技站，浙江 寧波 315171；2.寧波市鄞州區(qū)姜山鎮(zhèn)人民政府，浙江 寧波 315191）

自美國孟山都公司于1995年推出第1個抗草甘膦（農(nóng)達(dá)）玉米品種以來，抗除草劑作物的研發(fā)及推廣突飛猛進(jìn)。目前，轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米、大豆、棉花等作物在美國、巴西、阿根廷等國家的占有率已達(dá)100%。在轉(zhuǎn)基因作物帶來巨大的商業(yè)利益和社會效益的同時，其發(fā)展受到諸多因素的限制，如高昂的監(jiān)管批準(zhǔn)費用和國際貿(mào)易因素。相反，通過人工誘變（化學(xué)誘變或輻射誘變）突變除草劑靶標(biāo)基因產(chǎn)生的抗除草劑作物，由于不含轉(zhuǎn)基因成分，更容易被大眾接受，推廣面臨的政府審批程序也相對簡單。

除草劑通過干擾和抑制植物的代謝過程而造成雜草死亡。根據(jù)作用機(jī)制的不同，除草劑主要分為以下5種：生長調(diào)節(jié)劑、光和色素及相關(guān)組分的合成和代謝抑制劑、氨的代謝及氨基酸的生物合成抑制劑、脂類生物合成抑制劑以及光合電子傳遞系統(tǒng)抑制劑［1］。根據(jù)除草劑的作用機(jī)理，科學(xué)家針對除草劑靶標(biāo)設(shè)計、開發(fā)了大量的低劑量、高活性除草劑。其中，乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制劑和乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑是低用量、高效、低毒的兩類代表性除草劑，其靶標(biāo)蛋白編碼基因的特定位點突變后會增加植物對相應(yīng)除草劑的抗性。目前市場的非轉(zhuǎn)基因作物均為耐ALS抑制劑或耐ACCase抑制劑作物。非轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的獲得主要有人工誘變和基因編輯2種方法。

1 人工誘變

單核苷酸點突變是作物許多重要農(nóng)藝性狀發(fā)生變異的遺傳基礎(chǔ)。單堿基的變異會導(dǎo)致氨基酸替換或蛋白質(zhì)翻譯終止，使基因功能發(fā)生改變，從而有可能產(chǎn)生優(yōu)良的等位基因與優(yōu)異性狀。

1.1 乙酰乳酸合成酶

ALS以高度專一性和極高的催化效率催化兩分子的丙酮酸生成α-乙酰乳酸，進(jìn)一步合成纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸。ALS抑制劑通過抑制乙酰乳酸合成酶的活性，阻斷支鏈氨基酸的生物合成，進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)的合成，致使植物最終逐漸死亡［2］?，F(xiàn)已開發(fā)出的ALS抑制劑類除草劑共有約13類50余種，其中最具代表性的是咪唑啉酮類（Imidazolinones，IMs）和磺酰脲類（Sulfonylureas，SUs）。ALS 蛋白在 Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 171、Pro 196、Pro 197、Ala 205、Asp 376、Trp 537、Trp 548、Trp 552、Trp 557、Trp 563、Trp 574、Ser 621、Ser 627、Ser 638、Ser 653、Gly 654和Val 669等氨基酸位點（以模式植物擬南芥的ALS氨基酸位置計算）發(fā)生突變可以產(chǎn)生ALS抑制劑類除草劑抗性，這在多種農(nóng)作物（包括玉米、小麥、水稻、油菜和向日葵等）、模式植物擬南芥和上百種雜草中均有報道。而且不同位點的氨基酸殘基變異產(chǎn)生不同類型的ALS抑制劑類除草劑抗性。

巴斯夫公司通過自然選擇或化學(xué)誘變已培育了多種抗咪唑啉酮類除草劑作物，并將這些作物市場銷售的商標(biāo)命名為Clearfield。目前，在Clearfield體系下銷售的作物包括油菜、玉米、水稻、向日葵和小麥等。2017年7月，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院張保龍團(tuán)隊的“抗除草劑水稻ALS突變型基因?qū)＠夹g(shù)”成果轉(zhuǎn)化1 518萬，該成果含多個水稻ALS突變型基因?qū)＠约皩?yīng)的非轉(zhuǎn)基因抗咪唑啉酮類除草劑兩系恢復(fù)系、秈稻、粳稻等系列材料，均不含轉(zhuǎn)基因性狀，對防治水稻稗草、雜草稻等惡性雜草均具有較好的效果。

1.2 乙酰輔酶A羧化酶

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）催化乙酰輔酶A生成丙二酰輔酶A，是植物脂肪酸生物合成的關(guān)鍵限速酶。若丙二酰輔酶A合成停止，植物無法在脂肪酸合成酶的作用下形成脂肪酸，造成膜結(jié)構(gòu)破壞，透性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致植物死亡。ACCase是芳氧苯氧基丙酸類（AOPP）除草劑和環(huán)己烯酮類（CHD）除草劑的作用靶標(biāo)酶，這類除草劑對禾本科雜草有優(yōu)異的防除效果，屬于超高效型除草劑，使用范圍較廣［3］。

許多雜草因為羧基轉(zhuǎn)移酶功能域發(fā)生突變而獲得ACCase抑制劑抗性，大穗看麥娘（Alopecurus myosuroides）第1 781位由Ile突變?yōu)長eu后會獲得對除草劑的抗性，黑麥草（Lolium rigidum）、狗尾草（Setaria viridis）、野燕麥（Avena fatua）和黑麥草（Lolium multi fl orum）相同位點突變后也會產(chǎn)生除草劑抗性［4］。ACCase蛋白Ile1 204 Asn、Tyr 2027 Cys、Gly 2096 Ala、Asp 2078 Gly等位點突變后會表現(xiàn)出對芳氧苯氧丙酸酯類除草劑和環(huán)己烯酮類除草劑抗性［5］。

第一個報道的抗ACCase抑制劑作物為抗稀禾定（ACCase抑制劑）玉米，Parker等［6］通過組織培養(yǎng)篩選到3個株系B10S、B50S和B100S，這3個株系對稀禾定的抗性增加主要是通過提高ACCase的活性獲得的。巴斯夫最近開發(fā)了一款耐除草劑水稻系統(tǒng)Provisia?，Provisia除草劑是水稻乙酰輔酶A羧化酶抑制劑。該系統(tǒng)已于2017年獲得了美國環(huán)保署的登記，允許用于美國2018年種植季。這一系統(tǒng)能夠幫助水稻種植者實現(xiàn)更多的輪作管理，允許Clearfield（抗ALS抑制劑）水稻、Provisia水稻以及Roundup Ready（抗草甘膦）大豆或者LibertyLink（抗草銨膦）大豆進(jìn)行輪作，在不提高雜草抗性的情況下，實現(xiàn)連續(xù)的水稻種植［7］。

2 基因編輯

與人工誘變獲得抗除草劑作物相比，直接定點編輯除草劑靶基因是作物育種的一個主要目標(biāo)?；蚪M編輯技術(shù)可以在基因組靶向位點處產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB），以人為提供的外源供體DNA為模板，通過同源重組（HR）介導(dǎo)的DNA修復(fù)途徑來實現(xiàn)對目標(biāo)基因的單堿基突變。目前科學(xué)家已經(jīng)利用TALLEN和CRISPR/Cas9等因編輯技術(shù)成功獲得了抗除草劑的玉米和水稻。與人工誘變相比，堿基定點替換技術(shù)具有突變效率高、制作簡單及成本低等特點，在創(chuàng)造非轉(zhuǎn)基因成分種質(zhì)資源方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.1 ALS基因

ALS基因特定位點發(fā)生突變后會產(chǎn)生除草劑抗性，目前已有研究者分別通過TALLEN技術(shù)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)對玉米、水稻的ALS基因進(jìn)行定點編輯的報道。Svitashev等［8］首先報道通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)將玉米ALS2基因編碼產(chǎn)物第165位氨基酸由Pro變?yōu)镾er，突變后的植株表現(xiàn)出氯磺隆抗性。Li等［9］通過TALEN技術(shù)實現(xiàn)了水稻ALS基因編碼產(chǎn)物第548位氨基酸由Trp突變?yōu)長eu、第627位氨基酸由Ser突變?yōu)镮le，所得轉(zhuǎn)基因水稻實現(xiàn)了對雙草醚的抗性。Sun等［10］通過對CRISPR/Cas9技術(shù)也實現(xiàn)了水稻ALS基因這2個氨基酸位點定點替換，獲得了抗雙草醚除草劑水稻。

2.2 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）

5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）可以催化芳香族氨基酸的合成，是微生物（細(xì)菌、真菌）和高等植物中特有的合成氨基酸主要酶。目前生產(chǎn)上推廣的抗草甘膦作物，幾乎全部為通過導(dǎo)入草甘膦耐受性農(nóng)桿菌CP4-EPSPS基因獲得的。Li等［11］基于CRISPR/Cas9技術(shù)，實現(xiàn)了水稻內(nèi)源OsEPSPS基因保守區(qū)2個氨基酸的定點替換（Thr 102 Ile和Pro 106 Ser，TIPS），在T0代獲得了TIPS定點替換的雜合體，對草甘膦具有抗性。傳代分析結(jié)果表明，EPSPS基因的突變可以穩(wěn)定遺傳到下一代。

3 獲得抗除草劑作物的其他潛在基因

3.1 原卟啉原氧化酶（PPO）

原卟啉原氧化酶（PPO）催化原卟啉原IX生成原卟啉。PPO抑制劑類除草劑氟丙嘧草酯噴施后可以導(dǎo)致植物快速死亡，而PPO蛋白2個位點（Ser 305 Leu和Tyr 426 Met）發(fā)生變異后可以產(chǎn)生對氟丙嘧草酯的抗性。

3.2 α-微管蛋白（α-Tubulin）

Anthony等［12］和Yamamoto等［13］分別報道了牛筋草（Eleusine indica）α-微管蛋白發(fā)生Thr 249 Ile突變后會對高水平的二硝基苯胺產(chǎn)生抗性。該位點突變后的牛筋草還可以產(chǎn)生對氨基磷酸鹽類除草劑和吡啶類除草劑的交替耐藥性［14］。狗尾草中該位點突變后也表現(xiàn)出對二硝基苯胺的抗性，以及對苯甲酸類除草劑的交替耐藥性［15］。此外，牛筋草中α-微管蛋白Met 268 Thr和狗尾草Leu 136 Phe突變也可以產(chǎn)生對二硝基苯胺的抗性［16］。

4 展望

目前世界上推廣的非轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物如Clearfield系列、Provisia系列等全部為人工誘變所得，在美國、拉丁美洲、東南亞等國家和地區(qū)取得了重大成功。但傳統(tǒng)誘變及單堿基突變篩選技術(shù)（如TILLING）需要進(jìn)行基因組規(guī)模的篩選，耗時、耗力，而且鑒定到的點突變數(shù)目和種類有限。而基因編輯抗除草劑作物是利用基因工程技術(shù)對作物在基因組水平上進(jìn)行修飾獲得的，雖然不含有任何新引入的遺傳物質(zhì)或外源DNA，但是按照我國《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》定義，“農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物是指利用基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或者農(nóng)產(chǎn)品加工的動植物、微生物及其產(chǎn)品?！?，仍屬于轉(zhuǎn)基因的生物范疇。目前，抗褐變的基因編輯蘑菇和杜邦先鋒的基因編輯糯玉米品種已獲得了美國農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因監(jiān)管方面的豁免，基因編輯蘑菇已于2017在美國上市，基因編輯糯玉米最快也將于2021年問世?；蚓庉嫾夹g(shù)可能會被納入轉(zhuǎn)基因體系監(jiān)管，但是相信在將來基因編輯獲得的非轉(zhuǎn)基因抗除草劑農(nóng)作物品種定會與常規(guī)技術(shù)選育的品種一樣，不需要面臨轉(zhuǎn)基因監(jiān)管。