垂柳葉提取物抗氧化性及其協(xié)同效應(yīng)的初步研究

冀瑞萍，胡變芳，韓 笑

（晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中 030600）

垂柳（Salix babylonica L.）為楊柳科柳屬植物，在我國(guó)各地均有分布.明代李時(shí)珍所著《本草綱目》中早有記載，柳為本經(jīng)下品，其性寒、味微苦，具有祛風(fēng)、利尿、止痛、消腫的功能[1]2031.現(xiàn)代臨床上還將其用于治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、慢性氣管炎、燒燙傷[2]124.近期研究表明，柳葉乙醇提取物具有抗動(dòng)脈硬化的活性[3].現(xiàn)已知垂柳葉的成分種類大概包括：異黃酮、鞣質(zhì)、鄰苯二酚、生物堿、柳甾酮、山萘酚、槲皮素、酚類、糖苷類等[4].已見報(bào)道的具有抗氧化活性的天然物質(zhì)有：黃酮、鞣質(zhì)、苯丙素、香豆素、生物堿、萜類、烯酸、蒽醌、多糖、多肽等[5].

我國(guó)垂柳資源十分豐富，而它的藥用、抗氧化性等應(yīng)用價(jià)值尚未得到合理的開發(fā)利用.本文對(duì)垂柳葉提取物的抗氧化性及其與其他抗氧化劑的協(xié)同作用進(jìn)行了研究，以期為垂柳資源的綜合開發(fā)利用提供參考資料.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

垂柳樹葉：采集于晉中學(xué)院校園.于晴日清晨隨機(jī)摘取無(wú)蟲癭病害的新鮮柳葉，用清水洗凈，瀝干后放置烘箱中80℃烘干，粉碎備用.

大豆油：市售新制大豆油（清澈、淡黃色），來(lái)自晉中市榆次油廠.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

無(wú)水乙醇、三氯甲烷、冰乙酸、五水硫代硫酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、碘化鉀、檸檬酸、淀粉指示劑，以上均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)分析純.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州市長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）系列電子天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）、BGZ系列電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、MLS-3750高壓蒸汽滅菌器（三洋電機(jī)株式會(huì)社）、電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）.堿式滴定管、鐵架臺(tái)、碘量瓶、移液管、燒杯、稱量紙若干.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

參考GB/T5538-2005動(dòng)植物油脂過氧化測(cè)定方法[6]，采用間接碘量法氧化還原滴定反應(yīng)來(lái)測(cè)定油脂的過氧化值（POV，%）.油脂在氧化過程產(chǎn)生過氧化物，與碘化鉀作用生成游離碘，碘單質(zhì)會(huì)與淀粉指示劑反應(yīng)生成藍(lán)色復(fù)合物，以已知濃度的硫代硫酸鈉溶液滴定，反應(yīng)體系中的碘單質(zhì)即被還原，隨著硫代硫酸鈉的加入，當(dāng)溶液中的碘單質(zhì)消耗殆盡時(shí)，溶液藍(lán)色即消失，根據(jù)所消耗的硫代硫酸鈉溶液的體積即可算出油脂所含的氧化物的物質(zhì)的量，計(jì)算油脂的POV，從而得知油脂的氧化程度.

反應(yīng)原理如下：

2Na2S2O3+I2=Na2S4O6+2NaI

通過比較添加了柳葉提取物的油脂與空白油脂的氧化速度，可大致確定柳樹葉提取物的抗氧化能力.因油脂在剛開始氧化的72 h氧化速率較慢，氧化程度不甚明顯，綜合考慮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可用性，每隔48 h取樣進(jìn)行氧化還原滴定.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.2.1 制備柳葉提取物

①預(yù)處理：將垂柳干葉放入研缽中研磨至粉末，稱取50 g放入錐形瓶中.

②醇提：在錐形瓶中加入150mL乙醇溶液（75%），搖勻，置于遮光陰涼處，靜置24 h后抽濾，取濾液，待用.

③減壓蒸餾：將濾液進(jìn)行減壓蒸餾約5 h，直到乙醇不再蒸出時(shí)停止蒸餾，得粗提物，將粗提物放入小錐形瓶中，待用.

1.2.2.2 抗氧化性實(shí)驗(yàn)組的設(shè)置

分別稱取20 g油脂9份，置于50mL小錐形瓶中.其中第①份為空白對(duì)照；第②、③、④、⑤份分別按照油重的20%、40%、60%、80%，添加柳葉粗提物；第⑥、⑦份加入油重的40%柳葉粗提物并分別置于37℃、0℃保存；第⑧份加入油重40%的檸檬酸；第⑨份加入油重20%的柳葉粗提物及20%的檸檬酸.

表1 各實(shí)驗(yàn)組處理

將上述油脂樣品在70℃下攪拌混合均勻，使添加物充分溶解.為了促進(jìn)油脂的氧化，所有樣品每隔12 h充分?jǐn)嚢?min，重新放置.

1.2.2.3 試劑的配制

飽和碘化鉀溶液：稱取14 g碘化鉀，10mL水溶解，微熱使其溶解，冷卻后貯存于棕色瓶中.

三氯甲烷-冰乙酸溶液（2∶3）：取40mL三氯甲烷加60mL冰乙酸，混勻.

0.02mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取0.2486 g的五水硫代硫酸鈉以及0.002 g碳酸鈉，加入500mL煮沸過的無(wú)菌蒸餾水中.

淀粉指示劑（5 g/L）：稱取可溶性淀粉0.5 g，加入少許水，調(diào)成糊狀，倒入100mL沸水中調(diào)勻、煮沸，取上清液.

1.2.2.4 抗氧化值的測(cè)定

稱取2 g油脂（標(biāo)準(zhǔn)至0.0002 g）于碘量瓶中，加入20mL三氯甲烷-冰乙酸（2∶3）混合液，立即振搖使樣品完全溶加解，入1mL飽和碘化鉀溶液，加塞，輕輕振搖30 s，在暗處放置3min，取出后加入100mL蒸餾水，搖勻，立即用0.002mol/L的硫代硫酸鈉溶液滴定，當(dāng)溶液顏色變?yōu)榈S色時(shí)，加入1mL（5 g/L）淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失.

取相同量的三氯甲烷-冰乙酸溶液，碘化鉀溶液，蒸餾水，按同樣的方法做空白試劑實(shí)驗(yàn).

式中：

C（mol/L）：硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；

V（mL）：試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；

Vo（mL）：空白試劑消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；

M（g）：樣品質(zhì)量；

0.1269為換算常數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度粗提物對(duì)油脂的抗氧化性比較

初始值為0.087.

由表2可看出，各組油脂的POV隨時(shí)間推移而增大，表明油脂逐漸被空氣所氧化.其中，空白油脂的POV最大，隨著加入粗提物的濃度增大，油脂的過氧化值變小，隨著時(shí)間的推移，在144 h的滴定實(shí)驗(yàn)中，第④組60%和第⑤組80%的POV差異甚微，60%以上的濃度增加抗氧化效果增加不明顯.因此，設(shè)定濃度60%為垂柳葉粗提物抗氧化濃度的閾值.

表2 不同濃度提取物的抗氧化性能比較（POV）

2.2 相同濃度粗提物在不同溫度下對(duì)油脂的抗氧化性比較

由表3可看出，溫度對(duì)于油脂的氧化作用影響較明顯，溫度越高油脂的過氧化值越高，37℃處理的油脂氧化程度最高，5℃處理的油脂氧化程度最小.且隨著時(shí)間的推移，5℃處理的油脂POV變化幅度較室溫和37℃的處理組低.因此，添加抗氧化劑的油脂也應(yīng)保存于較低溫度下.

表3 相同濃度提取物在不同溫度下抗氧化性能比較（POV）

初始值為0.087.

2.3 相同濃度的粗提物與人工合成抗氧化劑對(duì)油脂的抗氧化性比較

由表4可看出，同樣添加量的情況下，垂柳葉粗提物的抗氧化性不如檸檬酸，但在粗提物與檸檬酸的協(xié)同作用下，油脂的氧化程度仍要比單純添加垂柳葉粗提物的油脂低，表明垂柳葉粗提物與檸檬酸有一定的協(xié)同增效作用.

表4 提取物與檸檬酸抗氧化性能比較（POV）

初始值為0.087.

3 討論

近幾年，天然抗氧化劑的開發(fā)與研究越來(lái)越受到重視[7～11]，本文研究了垂柳葉的抗氧化能力.

研究結(jié)果表明，垂柳葉粗提物具有一定的抗氧化作用，且其抗氧化性隨著濃度升高而增強(qiáng)，但60%為增強(qiáng)閾值；溫度垂柳葉抗氧化作用影響較明顯，溫度越高油脂的過氧化值越高，添加抗氧化劑的油脂也應(yīng)保存于較低溫度下.與檸檬酸等人工合成抗氧化劑相比，垂柳葉粗提物的抗氧化活性不如檸檬酸，但與檸檬酸協(xié)同作用后，抗氧化能力增強(qiáng).

垂柳葉粗提物的提取方法應(yīng)能夠?qū)⑺璩煞峙c其他成分進(jìn)行最大程度的分離且保證得率，本文采用75%乙醇、料液比1：3、時(shí)間24 h進(jìn)行提取，減壓蒸餾5 h，但更精細(xì)的提取方法需進(jìn)一步研究.

本文采用碘量滴定法對(duì)垂柳葉粗提物的POV進(jìn)行了測(cè)定，由于未去除提取物中的葉綠素，其較深的顏色對(duì)滴定終點(diǎn)的判斷也造成了一定的干擾，因此，應(yīng)進(jìn)一步探究更精確的測(cè)定方法.

同時(shí)，為了準(zhǔn)確了解垂柳葉中抗氧化活性成分，應(yīng)對(duì)活性成分進(jìn)行分離提取.

總之，柳樹栽種廣泛，柳葉來(lái)源豐富，成本較低.因此，從柳葉中提取抗氧化劑應(yīng)用于醫(yī)藥、美容、保健品開發(fā)具有一定的可行性.

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