不孕女性生殖道UU，CT，NG和MG感染狀況分析及不同檢測(cè)方法結(jié)果比較*

韓慕天，程洪波，王家雄，沈麗燕，王改改，宋　丹，楊慎敏，王馥新，許詠樂(lè)，王　瑋，李　紅，史軼超

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院生殖遺傳中心，江蘇蘇州　215000)

生殖道感染對(duì)女性生育的影響一直受到大家的重視，但個(gè)別生殖道微生物對(duì)生育的影響還存在著爭(zhēng)議[1]，如解脲支原體(ureaplasma urealyticum，UU)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，檢測(cè)方法也越來(lái)越精準(zhǔn)。新技術(shù)的出現(xiàn)讓我們能更快速和準(zhǔn)確地檢出各種生殖道病原體。流行病學(xué)研究表明，解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)、生殖支原體(MG)是非淋菌性尿道炎(NGU)最常見的病原體。其中UU的感染率為11%～26%，CT為11%～50%，MG為6%～50%[2]。UU是泌尿生殖道的常見微生物之一，因其可以分解尿素而得名[3]。目前，我國(guó)人群中UU的感染率日趨上升，由于反復(fù)感染以及抗生素濫用等原因，使之成為發(fā)病率較高的性傳播疾病之一。UU感染后，患者多無(wú)明顯癥狀，也易造成醫(yī)生漏診[4]。本文研究對(duì)象為不孕女性群體，旨在闡明該群體的生殖道微生物分布特征。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，生殖道病原體的檢測(cè)經(jīng)歷由培養(yǎng)法、免疫法到核酸檢測(cè)法多個(gè)階段[5～7]。病原體分離培養(yǎng)法被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”方法[8]。然而分離培養(yǎng)操作復(fù)雜，所需時(shí)間較長(zhǎng)和敏感度易受標(biāo)本采集方式等影響，對(duì)臨床常規(guī)檢測(cè)和流行病學(xué)篩查帶來(lái)了一定的困難。加之培養(yǎng)法取樣采用拭子樣本，該取樣方式給病患帶來(lái)一定的痛苦，尤其是男性患者，一些檢測(cè)方法結(jié)果判定具有一定的主觀性，容易引起假陽(yáng)性和假陰性，給臨床診斷帶來(lái)一些困難。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)也得到了廣泛的應(yīng)用[9]，但由于質(zhì)控困難，并且只能定性不能定量，加之有交叉抗原的存在[10]，故其應(yīng)用得到了很大的限制。DNA檢測(cè)技術(shù)有效地彌補(bǔ)上述不足，敏感度較高，其缺點(diǎn)在于不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以及無(wú)法區(qū)分死亡和活動(dòng)的病原體，故對(duì)于在治愈初期的病患，檢測(cè)結(jié)果也可能是陽(yáng)性[2]。故臨床上急需建立一種靈敏、可靠的檢測(cè)方法，以求能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出病原體。本研究運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Simultaneous amplification and testing，SAT)檢測(cè)女性陰道分泌物中的UU，CT，MG和NG，并將其與培養(yǎng)法及乳膠法進(jìn)行比較分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象2016年6～9月于本院生殖中心門診就診的不孕女性患者467例，年齡20～48歲，平均年齡31.52±6.83歲。其中352例行輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)治療。對(duì)照組選取105例已生育婦女體檢拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。采集標(biāo)本之前1月內(nèi)所有受試對(duì)象均未采取陰道灌洗、抗生素治療等措施，并處于非月經(jīng)期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)允許，患者知情同意。

1.2試劑與儀器UU，CT，NG和MG核酸檢測(cè)試劑盒(YZB/國(guó)3011- 2014)；MagX全自動(dòng)核酸提取儀(上海仁度生物科技有限公司)；定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)；UU培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒(珠海麗珠生物科技有限公司)；CT，NG乳膠免疫層析法試劑盒(南京黎明生物制品有限公司)。

1.3標(biāo)本采集用無(wú)菌棉拭子伸入女性宮頸口1～2 cm，旋轉(zhuǎn)幾周并停留數(shù)秒后取出，行ART的患者同時(shí)取兩份拭子標(biāo)本，分別用不同的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4樣本檢測(cè)

1.4.1培養(yǎng)法(用于UU檢測(cè))：將采集的標(biāo)本插入培養(yǎng)液中，擠壓旋轉(zhuǎn)三次，將培養(yǎng)液置于37℃溫箱中培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果，若培養(yǎng)液變?yōu)榧t色并清亮透明，即為陽(yáng)性。不變色即為陰性。若培養(yǎng)液變紅并伴有渾濁，則將培養(yǎng)液接種于10 mg/dl血平皿中，按照臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程對(duì)微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定。

1.4.2乳膠法(用于CT，NG檢測(cè))：將采集的標(biāo)本插入生理鹽水中，擠壓旋轉(zhuǎn)三次，即為待測(cè)樣本。測(cè)試時(shí)，將待測(cè)樣本滴入檢測(cè)卡加樣孔內(nèi)，陽(yáng)性標(biāo)本在測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)一條紅色條帶。陰性樣本由于不含檢測(cè)目的抗原，在測(cè)試區(qū)(T)內(nèi)不能形成夾心復(fù)合物，故沒(méi)有紅色條帶出現(xiàn)。

1.4.3SAT法：拭子標(biāo)本取出后放入1 ml生理鹽水充分浸泡后貼壁擠干，取0.5 ml與等體積的樣本保存液混合，即為待測(cè)樣本。使用MagX全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先，病原體被裂解釋放出核酸，與核酸提取液中的相應(yīng)磁性顆粒特異度結(jié)合，利用磁珠吸附純化UU，CT，NG和MG的靶標(biāo)RNA。加入42℃預(yù)熱的SAT酶液，于PCR儀上擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針與RNA拷貝特異性結(jié)合，產(chǎn)生的熒光由儀器進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判斷：dt表示樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的循環(huán)數(shù)，dt≤35的標(biāo)本判為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，兩方法對(duì)比使用配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)，當(dāng)T<1時(shí)使用Fisher確切概率法分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不孕女性生殖道UU，CT，NG和MG分布狀況467例不孕女性生殖道拭子UU，CT，NG和MG經(jīng)SAT法檢測(cè)結(jié)果如下。其中UU陽(yáng)性例數(shù)最多，陽(yáng)性率62.53%(292/467)。CT陽(yáng)性9例，陽(yáng)性率1.93%(9/467)。NG陽(yáng)性1例，陽(yáng)性率0.21%(1/467)。MG陽(yáng)性8例，陽(yáng)性率1.71%(8/467)。與正常生育女性組23.81%(25/105)對(duì)比，不孕女性組UU感染率明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.01，P<0.01)。

2.2UU培養(yǎng)法和SAT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率比較選取其中352例受檢女性進(jìn)行UU拭子培養(yǎng)和SAT檢測(cè)結(jié)果比較。SAT法檢測(cè)UU陽(yáng)性率為63.9%(225/352)，敏感度95.9%，特異度66.7%。培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性率為48.9%(172/352)，敏感度73.3%，特異度94.5%，兩樣本經(jīng)配對(duì)四格表χ2檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.93，P<0.01)。其中60例樣本拭子培養(yǎng)陰性而SAT法檢測(cè)陽(yáng)性，有7例樣本培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性SAT法檢測(cè)陰性。

2.3CT乳膠法和SAT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率比較352例受檢女性CT乳膠法檢測(cè)結(jié)果。SAT法檢測(cè)CT陽(yáng)性例數(shù)為6例，陽(yáng)性率1.7%(6/352)，敏感度100%，特異度98.6%。乳膠法檢測(cè)陽(yáng)性1例，陽(yáng)性率0.3%(1/352)，敏感度16.7%，特異度100%，兩樣本經(jīng)Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NG兩種檢測(cè)法均無(wú)陽(yáng)性檢出，MG僅用SAT法檢測(cè)未作比較。

3　討論

UU是泌尿生殖道常見的一種共生微生物，其感染與多種疾病相關(guān)，包括非淋菌性尿道炎、宮頸炎、慢性前列腺炎、附睪炎以及不孕不育等[11，12]。CT是一類胞內(nèi)寄生的微生物，能夠感染男、女性泌尿生殖道[13]。在女性中能引起盆腔炎、宮頸炎、宮內(nèi)感染等多種疾病[14]。然而在CT感染者中，約70%～80%的女性常常無(wú)明顯的臨床癥狀[15]，故可靠的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果對(duì)疾病的診斷顯得尤為重要。NG感染可導(dǎo)致一系列疾病，以宮頸炎和尿道炎最常見，并可進(jìn)一步上行入侵引起睪丸炎、盆腔炎、輸卵管炎，甚至擴(kuò)散至全身引起廣泛的炎癥反應(yīng)。淋病還可導(dǎo)致女性不孕、胎膜早破、異位妊娠和男性不育等病癥，使臨床檢測(cè)和治療面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[16]。MG不僅可以引起尿道炎和宮頸炎，并且近60%子宮內(nèi)膜炎患者的宮頸黏液中能夠檢測(cè)出MG[17]。MG感染與子宮內(nèi)膜炎和復(fù)發(fā)性盆腔炎有相關(guān)性[18]。值得一提的是，MG的檢測(cè)僅限于核酸擴(kuò)增試驗(yàn)。培養(yǎng)法所需時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要數(shù)月，并且敏感度不佳[19]。至今為止，血清學(xué)測(cè)定法和抗原檢測(cè)等方法均不能應(yīng)用于MG的檢測(cè)。核酸擴(kuò)增試驗(yàn)是MG唯一可行的診斷方法[20]。本研究結(jié)果顯示，不孕癥女性中UU感染率為62.53%，CT感染率為1.93%，NG感染率為0.21%，MG感染率為1.71%。UU是不孕女性生殖道檢出率最高的微生物。顯示UU和女性不孕癥存在著密切的關(guān)系。值得注意的是，本研究中CT或MG陽(yáng)性的患者中僅一例為UU陰性，其余均為并發(fā)感染，提示我們不同病原體感染之間可能存在著一定的關(guān)聯(lián)性。

隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，病原體檢測(cè)方法需要滿足準(zhǔn)確、高效和靈敏等要求。RNA檢測(cè)技術(shù)因其特異、靈敏的優(yōu)勢(shì)廣泛的用于生殖道病原體的檢測(cè)。RNA檢測(cè)技術(shù)包括SAT和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(transcription- mediated amplification，TMA)，這兩種檢測(cè)方法的擴(kuò)增原理完全相同。由于病原體細(xì)胞中的RNA存在多個(gè)拷貝，故RNA檢測(cè)技術(shù)相較于以DNA有更高的準(zhǔn)確度，更重要的是只有活的病原體中存在完整RNA片段，故能排除治愈后已死亡病原體對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[2]。RNA具有易降解、不穩(wěn)定的特性，使得該法交叉污染可能性更小，可以有效減少假陽(yáng)性的產(chǎn)生，大大提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，有助于臨床診斷的準(zhǔn)確度和對(duì)療效的監(jiān)測(cè)[21，22]。此外，RNA檢測(cè)結(jié)果還可以用于臨床療效監(jiān)測(cè)，符合精準(zhǔn)醫(yī)療的要求，是目前生殖道病原體檢測(cè)的首選方法。本研究中泌尿生殖道感染患者的拭子樣本，SAT法結(jié)果和培養(yǎng)法檢測(cè)UU相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SAT法的陽(yáng)性率更高，敏感度更強(qiáng)。這與鄭渠等[23]報(bào)道的培養(yǎng)法與SAT法檢測(cè)效能相當(dāng)不同。SAT法與乳膠法檢測(cè)CT結(jié)果相比，前者陽(yáng)性率以及敏感度亦明顯更高。基于SAT法可以以尿液檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，兼具檢測(cè)時(shí)間短、假陽(yáng)性率低等優(yōu)勢(shì)，尤其當(dāng)受檢者正處于感染初期，病原體數(shù)量較少，DNA含量少，而RNA較多，SAT法對(duì)該類病人的檢測(cè)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[24]，故該技術(shù)更適合作為體檢檢測(cè)方法進(jìn)行人群篩選。然而由于SAT法敏感度強(qiáng)，容易被環(huán)境中的病原體或異物污染，故對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件的要求更多，成本更高。此外，培養(yǎng)法可直接進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，有助于指導(dǎo)臨床用藥，該法更適合作為篩選后的確診方法。綜上所述，SAT法和常規(guī)法聯(lián)合檢測(cè)UU，CT，NG和MG將為臨床提供既準(zhǔn)確又快捷的診斷依據(jù)。

綜上所述，與其他方法比較，SAT法的優(yōu)勢(shì)更明顯，如無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、敏感度高，并且一份標(biāo)本可以進(jìn)行多個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)，避免多次取樣之間的差異。更重要的是運(yùn)用SAT法對(duì)病原體進(jìn)行定量檢測(cè)還可以應(yīng)用到分子生物學(xué)研究、流行病學(xué)的統(tǒng)計(jì)與調(diào)查、疾病的早期診斷、分型與預(yù)后等多個(gè)方面為臨床提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Babu G，Singaravelu BG，Srikumar R，et al．Comparative study on the vaginal flora and incidence of asymptomatic vaginosis among healthy women and in women with infertility problems of reproductive age[J]．J Clin Diagn Res，2017，11(8)：DC18- DC22．

[2]《非淋菌性尿道炎病原學(xué)診斷專家共識(shí)》編寫組，中華醫(yī)學(xué)會(huì)男科學(xué)分會(huì)．非淋菌性尿道炎病原學(xué)診斷專家共識(shí)[J]．中華男科學(xué)雜志，2016，22(11)：1038- 1043．

《Expert Consensus on Pathogen Diagnosis of Non- Gonococcal Urethritis》Write Group，Chinese Medical Association male science branch.Expert consensus on pathogen diagnosis of non- gonococcal urethritis[J]．National Journal of Andrology，2016，22(11)：1038- 1043．

[3]Taylor- Robinson D．Mollicutes in vaginal microbiology：Mycoplasmahominis，Ureaplasmaurealyticum，UreaplasmaparvumandMycoplasmagenitalium[J]．Res Microbiol，2017，168(9/10)：875- 881．

[4]Xie QZ，Xu WM，Qi QR，et al．Patients with cervicalUreaplasmaUrealyticumandChlamydiaTrachomatisinfection undergoing IVF/ICSI- ET：The need for new paradigm[J]．J Huazhong Univ Sci Technolog(Med Sci)，2016，36(5)：716- 722．

[5]Horner PJ，Blee K，F(xiàn)alk L，et al．2016 European gui- deline on the management of non- gonococcal urethritis[J]．Int J STD AIDS，2016，27(11)：928- 937．

[6]Takanashi M，Ito S，Kaneto H，et al．Development and clinical application of an InvaderPlus○Rassay for the detection of genital mycoplasmas[J]．J Infect Chemother，2015，21(7)：516- 519．

[7]Gerovassili A， Marcandona O， Asimakopoulos B，et al．Relationship between Chlamydia- Ureaplasma- Mycoplasma Genital detection with semen concentration and motility among greek men[J]．Int J Fertil Steril，2017，11(2)：130- 133．

[8]Rudkjobing VB，Thomsen TR，Xu Y，et al．Comparing culture and molecular methods for the identification of microorganisms involved in necrotizing soft tissue infections[J]．BMC Infect Dis，2016，16(1)：652．

[9]Schwebke JR，Rompalo A，Taylor S，et al．Re- evaluating the treatment of nongonococcal urethritis：emphasizing emerging pathogens- a randomized clinical trial[J]．Clin Infect Dis，2011，52(2)：163- 170．

[10]Nakashima K，Shigehara K，Kawaguchi S，et al．Pre- valence of human papillomavirus infection in the oropharynx and urine among sexually active men：a comparative study of infection by papillomavirus and other organisms，includingNeisseriagonorrhoeae，Chlamydiatrachomatis，Mycoplasmaspp，andUreaplasmaspp[J]．BMC Infect Dis，2014，14(2)：43- 48．

[11]Salmeri M，Valenti D，La Vignera S，et al．Prevalence ofUreaplasmaurealyticumandMycoplasmahominisinfection in unselected infertile men[J]．J Chemother，2012，24(2)：81- 86．

[12]Seifoleslami M，Safari A，Khayyat KM．Prevalence ofUreaplasmaurealyticumandMycoplasmahominisin high vaginal swab samples of infertile females[J]．Iran Red Crescent Med J，2015，17(12)：e16823．

[13]Phillips- Howard PA， Nyothach E， Ter Kuile FO，et al．Menstrual cups and sanitary pads to reduce school attrition，and sexually transmitted and reproductive tract infections：a cluster randomised controlled feasibility study in rural Western Kenya[J]．BMJ Open，2016，6(11)：e013229．

[14]Menon S， Timms P， Allan JA，et al．Human and pathogen factors associated with chlamydia trachomatis- related infertility in women[J]．Clin Microbiol Rev，2015，28(4)：969- 985．

[15]Foschi C，Salvo M，Cevenini R，et al．Chlamydia trachomatis antimicrobial susceptibility in colorectal and endocervical cells[J]．J Antimicrob Chemother，2017，34(6)：322- 330．

[16]Salfa MC，Suligoi B，Italian STI Laboratory- based surveillance Working Group．Prevalence ofChlamydiatrachomatis，TrichomonasvaginalisandNeisseriagonorrhoeaeBased on Data Collected by a Network of Clinical Microbiology Laboratories，in Italy[J]．Adv Exp Med Biol，2016，901：47- 57．

[17]Taylor- Robinson D，Jensen JS，Svenstrup H，et al．Difficulties experienced in defining the microbial cause of pelvic inflammatory disease[J]．Int J STD AIDS，2012，23(1)：18- 24．

[18]Cicinelli E，Matteo M，Tinelli R，et al．Chronic endometritis due to common bacteria is prevalent in women with recurrent miscarriage as confirmed by improved pregnancy outcome after antibiotic treatment[J]．Reprod Sci，2014，21(5)：640- 647．

[19]Gaydos CA．Mycoplasma genitalium：accurate diagnosis is necessary for adequate treatment[J]．J Infect Dis，2017，216(suppl 2)：S406- S411．

[20]Levina GA，Barkhatova OI，Gorina LG，et al．Unusual forms of persistence ofMycoplasmahominisin organism of infected humans[J]．Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol，2012(4)：104- 109．

[21]Centers for Disease Control and Prevention．Recommendations for the laboratory- based detection ofChlamydiatrachomatisandNeisseriagonorrhoeae- 2014[J]．MMWR Recomm Rep，2014，63(RR- 02)：1- 19．

[22]Martens MG，F(xiàn)ine P，F(xiàn)uller D，et al．Clinical evaluation of a new Pap test- based method for screening ofChlamydiatrachomatisandNeisseriagonorrhoeaeusing liquid- based cytology media[J]．South Med J，2013，106(9)：506- 512．

[23]鄭渠，劉瑋，張國(guó)巍，等．RNA恒溫?cái)U(kuò)增法與培養(yǎng)法檢測(cè)解脲脲原體結(jié)果比較分析[J]．中華男科學(xué)雜志，2017，23(8)：717- 721．

Zheng Q，Liu W，Zhang GW，et al．RNA simultaneous and amplification testing versus the culture method for detecting ureaplasma urealyticum infection[J]．National Journal of Andrology，2017，23(8)：717- 721．

[24]Ling Q， Song QX， Feng JL，et al．Prevalence ofChlamydiatrachomatis，Neisseriagonorrhoeae，MycoplasmagenitaliumandUreaplasmaurealyticuminfections using a novel isothermal simultaneous RNA amplification testing method in infertile males[J]．Ann Clin Microbiol Antimicrob，2017，16(1)：45- 54．