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    瓦氏雅羅魚(yú)殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析

    2018-02-09 08:26:15何亞鵬
    江西農(nóng)業(yè) 2018年1期
    關(guān)鍵詞:瓦氏單胞菌魚(yú)類

    李 博 何亞鵬 劉 寧

    瓦氏雅羅魚(yú),又被稱為華子魚(yú)、白魚(yú),是鯉科、雅羅魚(yú)亞科、雅羅魚(yú)屬的代表魚(yú)類。瓦氏雅羅魚(yú)最適宜的水質(zhì)為弱堿性,水溶氧量應(yīng)高于5 mg/L,透明度在30 cm左右。在這樣的水域中,瓦氏雅羅魚(yú)能保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)[1]。由于捕撈強(qiáng)度的增加、生態(tài)環(huán)境的變遷以及疫病的影響,瓦氏雅羅魚(yú)的數(shù)量逐漸減少,瓦氏雅羅魚(yú)作為北京土著魚(yú)類,是北京市二級(jí)保護(hù)魚(yú)類,其資源現(xiàn)狀堪憂。

    殺鮭氣單胞菌是一種革蘭氏陰性短桿菌,隸屬于氣單胞菌屬氣單胞菌科。該菌在全球范圍內(nèi)分布廣泛,可引起鮭魚(yú)科魚(yú)類的“癤瘡病”和“敗血癥”,典型臨床癥狀為魚(yú)體表面多處潰爛。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌也可感染其他魚(yú)類,如鯉科魚(yú)類,該菌還可與其他細(xì)菌混合感染,對(duì)鮭魚(yú)科和鯉科魚(yú)類危害很大[2]。本試驗(yàn)從北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心馴養(yǎng)車(chē)間患病的瓦氏雅羅魚(yú)體內(nèi)分離純化出1株殺鮭氣單胞菌,然后對(duì)其進(jìn)行了理化特性、分子生物學(xué)特性及耐藥性分析,并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇用藥,有效地對(duì)瓦氏雅羅魚(yú)進(jìn)行了救護(hù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料 患病的瓦氏雅羅魚(yú)來(lái)源于北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心馴養(yǎng)車(chē)間。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、生化鑒定試劑和藥敏紙片均購(gòu)自北京賽為思生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心,細(xì)菌DNA提取試劑盒(DP302)、2×Pfu PCR Master Mix(KP201)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)菌的分離 取患病的瓦氏雅羅魚(yú),在超凈工作臺(tái)內(nèi)采集內(nèi)臟,劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,28 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h,觀察形成的菌落的形態(tài)、顏色和大小等。將分離菌進(jìn)行革蘭染色,在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

    1.2.2 生理生化鑒定 將菌株分別在無(wú)菌條件下穿刺接種于細(xì)菌生化鑒定管中,根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)該菌株進(jìn)行系統(tǒng)的理化特性測(cè)定[3]。

    1.2.3 16S rDNA基因的擴(kuò)增 采用16S rDNA通用引物(上游16SF:5’-CTAAGCCAGGATCAAACTCT-3’;下游16SR:5’-AAGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’)。 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的DNA作為模板,按常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察目的條帶大小。陽(yáng)性樣品由華大基因公司測(cè)序。

    1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用K-B法對(duì)分離菌株的藥物敏感性進(jìn)行檢測(cè)。將培養(yǎng)16 h的該分離菌菌液涂布在檢測(cè)平板上,平板于室溫中放置4 min等待干燥,在合適區(qū)域貼上藥敏紙片,室溫放置10 min后,倒置于28 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h,在黑色無(wú)反光的背景下測(cè)量包括紙片直徑在內(nèi)的抑菌圈直徑,判定該菌的藥物敏感性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 臨床癥狀 患病的瓦氏雅羅魚(yú)鱗片大面積脫落,身體表面存在多處出血,鰓蓋和眼周出血,尾部有潰爛。

    2.2 細(xì)菌形態(tài) 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落為圓形、不透明、表面光滑、隆起及邊緣整齊,菌落為中等大小。染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭氏陰性的短桿狀細(xì)菌。

    2.3 理化特性 由分離菌的生化鑒定結(jié)果可知,該菌株不具有動(dòng)力性,枸櫞酸鹽、氧化酶、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、賴氨酸脫氫酶、尿素、蔗糖和VP試驗(yàn)均為陰性,半乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、七葉苷和葡萄糖試驗(yàn)為陽(yáng)性。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,將其初步判定為殺鮭氣單胞菌。

    2.4 16S rDNA的擴(kuò)增結(jié)果及序列分析 以分離細(xì)菌的DNA為模板,用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約1 500 bp的核酸片段(見(jiàn)圖1)。將分離菌的測(cè)序結(jié)果用GenBank中的BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì),結(jié)果表明該序列和殺鮭氣單胞菌的殺鮭亞種代表株相似性在99%以上,表明該菌株為殺鮭氣單胞菌。

    圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

    2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)表明,該分離菌株對(duì)強(qiáng)力霉素、阿米卡星等抗生素敏感,對(duì)利福平、紅霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等中度敏感,對(duì)青霉素、甲氧卞胺嘧啶、卡那霉素等藥物耐受。

    2.6 用藥結(jié)果 根據(jù)上述藥敏試驗(yàn)結(jié)果,選擇強(qiáng)力霉素和阿米卡星拌料治療,同時(shí)在池水中加入抗菌中草藥,對(duì)發(fā)病的魚(yú)池采用聚維酮碘消毒,短時(shí)間內(nèi)有效地控制了該疫情。

    3 討論

    殺鮭氣單胞菌可引起鮭魚(yú)科、鯉科等魚(yú)類產(chǎn)生皮膚潰爛等癥狀,以至出現(xiàn)敗血癥、死亡,對(duì)魚(yú)類養(yǎng)殖和魚(yú)種保護(hù)造成嚴(yán)重的損失[4-5]。本試驗(yàn)中瓦氏雅羅魚(yú)感染殺鮭氣單胞菌的原因可能是魚(yú)剛到新的水體環(huán)境中,由于應(yīng)激和飼養(yǎng)模式變化等原因,導(dǎo)致魚(yú)的抵抗力下降,從而感染該菌,導(dǎo)致疾病。動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中常選用抗生素進(jìn)行細(xì)菌性疾病的防治,但其選擇和使用需要有科學(xué)性,長(zhǎng)期不合理使用同種藥可誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生耐藥性,藥物會(huì)失去作用,動(dòng)物體內(nèi)也會(huì)有大量藥殘。因此,在選擇藥物前需要做好藥敏試驗(yàn),合理慎重用藥。本研究可為進(jìn)一步研究殺鮭氣單胞菌的防治奠定基礎(chǔ),為殺鮭氣單胞菌感染的臨床用藥提供參考。

    [1]孟和平,韓國(guó)蒼,高玉奎,等.達(dá)里湖鯽魚(yú)、瓦氏雅羅魚(yú)資源的可持續(xù)發(fā)展[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè),2015(10):48.

    [2]王海娟,王利.鯉魚(yú)殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2015(1):192-196.

    [3]蔡妙英,東秀珠.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:364-399.

    [4]劉寧,時(shí)曉,杜迎春,等.患病細(xì)鱗魚(yú)殺鮭氣單胞菌的分離與鑒定[J].淡水漁業(yè),2015(1):88-92.

    [5]王家禎,耿昕穎,董文龍,等.3株殺鮭氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2017(2):78-80.

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