• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    繡球菌雙向液體發(fā)酵條件優(yōu)化及其菌絲體多糖抗氧化活性分析

    2022-12-07 11:37:00任亞倩莊孟穎劉興健吳小平張君麗鄭明鋒傅俊生
    關鍵詞:松針菌絲體馬尾松

    任亞倩,莊孟穎,劉興健,吳小平,張君麗,鄭明鋒,傅俊生

    (1 福建農(nóng)林大學 a 食品科學學院,b 生命科學學院,福建 福州 350002;2 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院 蔬菜研究所, 西藏 拉薩 850000)

    繡球菌(Sparasiscrispa)隸屬擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、繡球菌科、繡球菌屬[1],其子實體玲瓏似花瓣,晶瑩剔透,呈白色或奶黃色,是一種珍貴的食藥用菌。多糖是繡球菌的主要活性成分之一,具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、調節(jié)免疫[4]等功能。由于繡球菌子實體野生資源有限,目前雖已實現(xiàn)人工栽培,但其栽培周期長、生產(chǎn)成本高,這在很大程度上限制了繡球菌相關產(chǎn)品的開發(fā)及應用[5]。然而,菌絲體具有生產(chǎn)周期短、提取加工方便等特點,被認為是一種潛在可替代子實體擴大食用菌開發(fā)利用的有效途徑,因此如何促進繡球菌菌株快速生長,高效生產(chǎn)菌絲體就顯得至關重要[6]。

    雙向發(fā)酵是一種通過添加藥性基質促進目的菌株快速生長的方法,具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、不受環(huán)境限制、成本低等優(yōu)點,在真菌的發(fā)酵生產(chǎn)中應用廣泛[7]。解文利等[8]探究了銀杏葉對紫紅曲霉雙向發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)其可以促進紫紅曲霉的生長。胡永樂等[9]研究了厚樸對蛹蟲草雙向液體發(fā)酵的影響,發(fā)現(xiàn)其能在短時間內(nèi)有效地提高蛹蟲草菌絲體生物量并釋放各類代謝產(chǎn)物。

    馬尾松松針是松科植物馬尾松(PinusmassonianaLamb)的葉[10],是一種重要的中藥材,其主要活性成分為揮發(fā)油類、木脂素類、黃酮類等,具有祛風活血、明目安神等功效[11-12]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn),馬尾松松針能夠有效地促進繡球菌菌絲體的生長,但目前還未見關于馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對菌絲體生產(chǎn)影響的研究。為進一步提高繡球菌菌絲體生物量,本研究采用單因素試驗和正交試驗對馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵的條件進行了優(yōu)化,并對菌絲體多糖的抗氧化活性進行了分析,以期為繡球菌菌絲體的高效生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 菌 種 繡球菌菌種,由福建農(nóng)林大學生命科學學院田間1-11試驗室保藏,菌株編號RY01。

    1.1.2 試劑和儀器 葡萄糖、蛋白胨、瓊脂等試劑,均為國產(chǎn)分析純試劑;2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),購于Sigma公司。主要儀器有電熱鼓風干燥箱 (DHG-9070A,常州普天儀器制造有限公司)、高速萬能粉碎機(GN20,杭州旭眾機械設備有限公司)、恒溫搖床 (KH-300,常州市凱航儀器有限公司)、電子天平(FA104,上海力辰儀器科技有限公司)、pH計(PHS-3C,上海儀天科學儀器有限公司)和紅外光譜儀(德國Bruker有限公司)。

    1.1.3 培養(yǎng)基 (1) 基礎培養(yǎng)基的制備。將土豆200 g于1.2 L沸水煮沸30 min,用3層紗布過濾,收集土豆浸提液,依次加入葡萄糖20 g,蛋白胨5 g,瓊脂2 g,攪拌溶解,加水定容至1 L,121 ℃高壓滅菌30 min。

    (2) 繡球菌液體菌種制備。將繡球菌菌株接種于裝有100 mL基礎培養(yǎng)基的錐形瓶中,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)20 d,用無菌水稀釋,調整菌液質量濃度為50 g/L,備用。

    1.1.4 馬尾松松針粉 馬尾松松針采自福建農(nóng)林大學中華名特優(yōu)植物園。將采摘的馬尾松松針于50 ℃烘干,粉碎后過孔徑0.175 mm的標準篩,備用。

    1.2 雙向液體發(fā)酵單因素試驗

    采用單因素試驗分別探究馬尾松松針粉添加量、發(fā)酵時間、繡球菌接種量及發(fā)酵液pH對繡球菌菌絲體生物量的影響。

    1.2.1 馬尾松松針粉添加量 于90 mL基礎培養(yǎng)基中分別加入50,75,100,125,150 mg馬尾松松針粉,121 ℃滅菌30 min后,冷卻至室溫,然后每個搖瓶中接入10 mL質量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L),最終培養(yǎng)基中馬尾松松針粉添加量分別0.50,0.75,1.00,1.25,1.50 g/L,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)16 d后,測定菌絲體生物量。每組試驗重復3次,結果取平均值。菌絲體生物量的測定:對液體發(fā)酵產(chǎn)物于25 ℃條件下抽濾3 h,分離發(fā)酵液和菌絲體,用蒸餾水反復沖洗菌絲體至表面無馬尾松松針粉末殘留,用濾紙吸干表面殘留水分,于50 ℃烘干后稱質量。

    1.2.2 發(fā)酵時間 于90 mL基礎培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L),121 ℃高壓滅菌30 min后,冷卻至室溫,然后每個搖瓶接入10 mL質量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L),于25 ℃、160 r/min條件下分別培養(yǎng)12,16,20,24,28,32 d,測定菌絲體生物量。每組試驗重復3次,結果取平均值。

    1.2.3 繡球菌接種量 于90 mL基礎培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L),121 ℃高壓滅菌30 min,冷卻至室溫,分別接入不同體積50 g/L的繡球菌液體菌種,控制培養(yǎng)基總體積為100 mL,繡球菌的最終接種量分別為25,50,75,100,125,150 mL/L,于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 d,測定菌絲體生物量。每組試驗重復3次,結果取平均值。

    1.2.4 發(fā)酵液pH 于90 mL基礎培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L),用氫氧化鈉和鹽酸分別調節(jié)pH至4,5,6,7和8,121 ℃滅菌30 min,冷卻至室溫,然后每個搖瓶接入10 mL質量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L),于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 d,測定菌絲體生物量。每組試驗重復3次,結果取平均值。

    1.3 雙向液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

    基于雙向液體發(fā)酵單因素試驗結果,以菌絲體生物量為考察指標,對馬尾松松針粉添加量、發(fā)酵時間、接種量和發(fā)酵液pH進行4因素3水平的正交試驗,篩選最佳發(fā)酵條件。試驗設計見表1。

    表1 繡球菌液態(tài)發(fā)酵條件正交試驗因素及水平

    在正交試驗優(yōu)化得到最佳條件的基礎上,控制其他條件一致,試驗設置了馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵組(以下簡稱雙向發(fā)酵組)和未添加馬尾松松針粉的對照組2個處理,每組3個重復,對最佳條件進行驗證。

    1.4 菌絲體多糖制備

    以未添加馬尾松松針粉的處理為對照組,參照李瑞雪等[13]的方法,將烘干后的對照組和雙向發(fā)酵組繡球菌菌絲體粉碎,過孔徑0.175 mm的標準篩,取一定量菌絲體粉末,按料液比1 (g)∶30 (mL)比例加入蒸餾水,90 ℃提取3 h,離心收集上清液后旋蒸濃縮,4 ℃醇沉過夜,收集沉淀,加水復溶后,采用Sevage法除去蛋白雜質,冷凍干燥得到繡球菌菌絲體多糖(Sparassiscrispapolysaccharides,SCP)。

    1.5 菌絲體多糖的結構分析

    參照李晉等[14]的方法,分別稱取對照組和雙向發(fā)酵組SCP粉末2 mg,加入200 mg烘干至恒質量的KBr粉末,混勻后充分研磨,利用壓模機壓成片后,采用紅外光譜對其進行結構表征。

    1.6 菌絲體多糖的抗氧化活性分析

    1.6.1 對ABTS自由基清除率 參考雷燕妮等[15]的方法并略作調整進行試驗。配置雙向發(fā)酵組不同質量濃度(0.25,0.5,1,2,4 mg/mL)的SCP溶液,以相同質量濃度的維生素C為對照,測定SCP對ABTS自由基清除率。具體方法為:在試管中分別加入0.8 mL的ABTS工作液和0.2 mL不同質量濃度的樣品溶液,振蕩混勻10 s,于25 ℃條件下避光反應6 min,在波長734 nm處測定吸光值(Ai),以蒸餾水分別替代樣品溶液和ABTS工作液,在波長734 nm處測定吸光值(分別記為Aj和Aij)。每組試驗重復3次,結果取平均值。計算ABTS自由基的清除率:

    ABTS自由基清除率=[1-(Ai-Aij)/Aj]×100%。

    1.6.2 對羥基自由基的清除率 參考Lai等[16]的方法并略作調整進行試驗。以相同質量濃度的維生素C為對照,采用水楊酸-硫酸亞鐵法測定SCP對羥基自由基的清除率。具體方法為:在試管中依次加入9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L的FeSO4溶液、不同質量濃度的樣品溶液和8.8 mmol/L的H2O2溶液各0.1 mL,加蒸餾水補足至1 mL,渦旋混勻5 s,于37 ℃條件下反應30 min,在波長510 nm處測定吸光度(Aa),以0.1 mL蒸餾水分別替代樣品溶液和H2O2溶液,于波長510 nm處測定吸光度(分別記為Ab和Aab)。每組試驗重復3次,結果取平均值。計算SCP對羥基自由基的清除率:

    羥基自由基清除率=[1-(Aa-Aab)/Ab]×100%。

    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。采用SPSS 24.0軟件分析處理,組間比較采用Duncan’s檢驗。

    2 結果與分析

    2.1 不同單因素對繡球菌液體發(fā)酵的影響

    2.1.1 馬尾松松針粉添加量 圖1顯示,當馬尾松松針粉添加量為0.50~1.25 g/L時,繡球菌菌絲體的生物量隨著松針粉添加量的增加而顯著提高;當松針粉添加量大于1.25 g/L時,繡球菌菌絲體生物量趨于穩(wěn)定,從節(jié)約資源的角度考慮,馬尾松松針粉添加量選取1.25 g/L較為合適。

    2.1.2 發(fā)酵時間 圖2顯示,當發(fā)酵時間為12~24 d時,繡球菌菌絲體生物量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加;當發(fā)酵時間超過24 d,隨著發(fā)酵時間的延長菌絲體生物量不再發(fā)生顯著變化。從縮短發(fā)酵周期的角度考慮,發(fā)酵時間選取24 d較為合適。

    圖柱上標不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同

    2.1.3 繡球菌接種量 圖3顯示,當繡球菌接種量為25~100 mL/L時,繡球菌菌絲體生物量隨著接種量的增大而顯著增加;接種量大于100 mL/L時,菌絲體生物量呈下降趨勢,這可能與菌株在單位體積內(nèi)對營養(yǎng)成分的過度競爭致使培養(yǎng)基中溶氧不足,菌絲體的生長受到抑制有關。因此,選取100 mL/L為繡球菌適宜接種量。

    圖3 繡球菌接種量對菌絲體生物量的影響

    2.1.4 發(fā)酵液pH 圖4顯示,在供試pH范圍內(nèi),繡球菌菌絲體生物量隨著pH的提高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在pH為5時,菌絲體生物量達到最高。因此,發(fā)酵液pH設定為5較為合適。

    2.2 繡球菌雙向液體發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

    表2顯示,馬尾松松針粉添加量中k3最大,發(fā)酵時間中k2最大,pH中k1最大,接種量中k3最大,此條件(第8試驗組)下菌絲體生物量最高。試驗過程中觀察菌絲顏色及大小情況發(fā)現(xiàn),第3試驗組和第7試驗組菌絲體顏色偏黃,且菌球顆粒大小不一;第8試驗組菌絲體顏色偏白,且顆粒均勻。綜上可以得出,繡球菌雙向液體發(fā)酵的最佳條件為:馬尾松松針粉添加量1.25 g/L、發(fā)酵時間24 d、pH 4、接種量125 mL/L,在此條件下繡球菌菌絲體生物量可達到(11.25±0.18) g/L。

    表2 繡球菌雙向液體發(fā)酵正交試驗結果

    表2顯示,4個單因素中,pH的極差(R)最大,馬尾松松針粉添加量次之,接種量和發(fā)酵時間均較小,表明影響雙向液體發(fā)酵產(chǎn)繡球菌菌絲體的主要因素是pH和馬尾松松針粉添加量。結合方差分析結果(表3)可知,pH的F值最大,為404.209;馬尾松松針粉添加量的F值次之,為15.589;接種量和發(fā)酵時間的F值均較小,分別為8.051和0.401。由R值和F值可知,4個因素對銹球菌菌絲體生物量影響大小的順序為:發(fā)酵液pH>馬尾松松針粉添加量>繡球菌接種量>發(fā)酵時間。

    表3 繡球菌雙向液體發(fā)酵正交試驗結果的方差分析

    2.3 繡球菌雙向液體發(fā)酵最佳條件的驗證

    在2.2節(jié)正交試驗得到的最佳條件下,馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵組菌絲體生物量可達(11.16±0.22) g/L,與未添加馬尾松松針粉的對照組((4.26±0.19) g/L)相比,菌絲體生物量顯著提高了約162.10%,可知馬尾松松針能夠顯著地提高繡球菌菌絲體的生物量。

    2.4 繡球菌菌絲體多糖的結構分析

    圖5結果顯示,雙向液體發(fā)酵獲得的繡球菌菌絲體多糖紅外光譜主要特征吸收峰與對照組一致,說明馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對菌絲體多糖的結構影響較小。

    圖5 雙向液體發(fā)酵繡球菌菌絲體多糖的紅外光譜分析

    2.5 繡球菌菌絲體多糖的抗氧化活性分析

    圖6-A結果顯示,在設定質量濃度范圍內(nèi),SCP對ABTS自由基的清除能力隨其質量濃度的增大而不斷增強,當SCP質量濃度為4 mg/mL時,其對ABTS自由基清除率可達到99.72%。由圖6-B可知,在設定質量濃度范圍內(nèi),SCP對羥基自由基的清除率隨其質量隨濃度的增大而不斷提高,當SCP質量濃度為4 mg/mL時,其對羥基自由基的清除率可達到68.22%。

    圖柱上標不同小寫字母表示同一種物質不同質量濃度間差異顯著(P<0.05)

    3 討論與結論

    液體發(fā)酵技術是菌株擴繁的重要方法,但傳統(tǒng)液體發(fā)酵手段難以實現(xiàn)菌株的高效快速生長,雙向液體發(fā)酵是利用中藥材所富含的活性成分刺激菌絲體的生長,可在短時間內(nèi)實現(xiàn)菌株的快速繁殖[17]?;陔p向發(fā)酵的原理,本試驗嘗試通過馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵來提高菌絲體的生物量。單因素試驗發(fā)現(xiàn),當馬尾松松針粉添加量大于1.25 g/L,菌絲生物量不再明顯提高,這可能是由于馬尾松松針中的活性成分在達到一定量后對繡球菌菌絲體生長的促進作用達到了平臺期。當發(fā)酵時間超過24 d后,繡球菌菌絲體生物量隨著發(fā)酵時間的延長而下降,這可能是由于發(fā)酵后期培養(yǎng)基中溶氧量降低從而引起菌絲體老化自溶所致。當接種量為125~150 mL/L時菌絲體生物量明顯下降,這可能是由于接種量過大,菌株對物質能量的消耗過快,導致單位體積培養(yǎng)體系內(nèi)營養(yǎng)成分和溶氧不足,使得菌絲體的生長受到抑制[18]。當pH≥6時,繡球菌菌絲體生物量顯著下降,可知偏中性或堿性環(huán)境對其生長產(chǎn)生了不同程度的抑制作用,且發(fā)酵中后期菌球顏色逐漸加深,呈現(xiàn)不同程度的灰色,菌絲幾乎無法生長,這可能是由于pH的升高抑制了與菌株生長相關的酶的活性[19],此時馬尾松松針粉不能發(fā)揮對繡球菌菌絲生長的促進作用。

    采用正交試驗進一步優(yōu)化馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵條件,得到最佳發(fā)酵條件為:馬尾松松針粉添加量1.25 g/L、發(fā)酵時間24 d、接種量125 mL/L、pH為4,在此條件下繡球菌菌絲體生物量可達11.16 g/L。已有關于繡球菌液體培養(yǎng)的研究多集中于發(fā)酵條件的優(yōu)化,2006年Kurosumi等[20]研究得出繡球菌的液體培養(yǎng)條件為:葡萄糖添加量為30 g/L、pH值為5,該條件下菌絲體的產(chǎn)量可達7.95 g/L。胡爽[21]對繡球菌突變菌株液體培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化,使菌絲體的生物量較優(yōu)化前提高了約60%。本研究利用雙向發(fā)酵原理探究馬尾松松針對繡球菌菌絲體生長的影響,試驗結果表明,馬尾松松針可以顯著促進繡球菌菌絲體的生長,與對照組相比,雙向發(fā)酵組菌絲體生物量提高了約162.10%。

    為探究馬尾松松針是否會對繡球菌菌絲體多糖的結構產(chǎn)生影響,本試驗進一步對添加馬尾松松針與未添加馬尾松松針發(fā)酵的繡球菌菌絲體多糖的結構進行了紅外光譜分析。結果表明,兩組菌絲體多糖的紅外光譜主要吸收峰一致,表明馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對繡球菌菌絲體多糖的結構影響較小。多糖作為繡球菌的重要活性成分,一直是科研工作者探究的熱點之一。于韋韋[22]研究發(fā)現(xiàn),繡球菌多糖可通過誘導乳腺癌細胞凋亡抑制腫瘤生長;高淵等[23]研究發(fā)現(xiàn),繡球菌多糖可能通過調控機體氨基酸代謝和脂質代謝緩解高脂血癥大鼠的血脂異常。在繡球菌多糖的活性功能探究中,關于菌絲體多糖抗氧化活性的研究相對較少,因此本試驗對其抗氧化活性進行了研究,結果顯示,繡球菌菌絲體多糖對ABTS自由基、羥基自由基的清除能力呈現(xiàn)劑量依賴性,具有較好的抗氧化能力。機體氧化代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基過量時會誘發(fā)脂質過氧化,導致細胞膜和核酸的氧化損傷,進而造成免疫力下降,引發(fā)多種疾病[24-25]。目前越來越多的研究表明,多糖具有良好的自由基清除能力和抑制脂質過氧化作用,初步認為多糖的抗氧化能力與其結構、官能團、分子量、單糖組成等有關[26],本試驗對繡球菌多糖的結構及單糖組分未進行深入研究,后續(xù)試驗可通過多糖分離純化、結構解析結合細胞試驗進一步探究其抗氧化機理。

    綜上,馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵可有效提高繡球菌菌絲體生物量,在最適條件下其菌絲體生物量可達11.16 g/L,而且所得菌絲體多糖具有良好的抗氧化活性。馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵方法為繡球菌菌絲體的高效生產(chǎn)提供技術支持。

    猜你喜歡
    松針菌絲體馬尾松
    松針
    都市(2023年6期)2023-12-28 07:56:52
    松針掃把
    馬尾松栽培技術及撫育管理
    綠色科技(2019年5期)2019-11-29 13:17:37
    馬尾松果糖-1,6-二磷酸酶基因克隆及表達模式分析
    馬尾松初級種子園復壯技術
    24年生馬尾松種子園自由授粉子代測定及家系選擇
    葡萄糖酸鈉發(fā)酵廢棄菌絲體提取殼聚糖的研究
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:25
    新型環(huán)保吸聲材料——菌絲體膠合秸稈
    安全(2015年7期)2016-01-19 06:19:39
    冬蟲夏草發(fā)酵液和菌絲體中主要核苷類成分分析
    松針入藥驗方選
    中老年健康(2015年5期)2015-05-30 06:21:18
    日韩欧美精品免费久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 2018国产大陆天天弄谢| 美女大奶头黄色视频| 不卡视频在线观看欧美| 在线播放无遮挡| 免费黄频网站在线观看国产| videos熟女内射| 免费看av在线观看网站| 国产亚洲一区二区精品| 国产在视频线精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 九色成人免费人妻av| av福利片在线| 视频区图区小说| 黄片无遮挡物在线观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲欧美精品自产自拍| 免费观看av网站的网址| 国产高清不卡午夜福利| 插逼视频在线观看| 波野结衣二区三区在线| 少妇高潮的动态图| 亚洲人成77777在线视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 在线精品无人区一区二区三| 欧美激情极品国产一区二区三区 | av视频免费观看在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 一级黄片播放器| 另类精品久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品久久久久久精品电影小说| 午夜福利影视在线免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91精品伊人久久大香线蕉| 91精品国产国语对白视频| 国产高清有码在线观看视频| 22中文网久久字幕| 晚上一个人看的免费电影| 黑人高潮一二区| 最新中文字幕久久久久| 国产 一区精品| 少妇被粗大猛烈的视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 大香蕉久久成人网| 日韩一本色道免费dvd| 观看av在线不卡| 一区二区av电影网| 国产伦精品一区二区三区视频9| 各种免费的搞黄视频| 精品一区二区免费观看| 日韩精品有码人妻一区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| www.色视频.com| 黑人高潮一二区| 精品久久国产蜜桃| 精品久久久久久久久av| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产高清国产精品国产三级| 久久久久久久精品精品| 黄色怎么调成土黄色| 在线观看免费高清a一片| 亚洲欧美清纯卡通| a级毛片黄视频| 亚洲精品第二区| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 午夜影院在线不卡| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一个人看视频在线观看www免费| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲少妇的诱惑av| 精品亚洲成国产av| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 最近手机中文字幕大全| 制服人妻中文乱码| 黄色怎么调成土黄色| 精品国产国语对白av| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产av一区二区精品久久| 在线播放无遮挡| 久久久久久久久久久免费av| 成人亚洲精品一区在线观看| 全区人妻精品视频| 国产成人精品无人区| 国产黄色免费在线视频| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲av男天堂| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 久久午夜福利片| av国产精品久久久久影院| 亚洲高清免费不卡视频| 一本一本综合久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久久久久久大尺度免费视频| av在线app专区| 中文字幕久久专区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲中文av在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲一区二区三区欧美精品| 中文欧美无线码| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 人妻系列 视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精品一区蜜桃| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 看十八女毛片水多多多| 国产精品 国内视频| 日本午夜av视频| 成人国语在线视频| 丰满乱子伦码专区| 性色avwww在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日日啪夜夜爽| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产高清不卡午夜福利| 两个人的视频大全免费| 91国产中文字幕| 亚洲伊人久久精品综合| 精品久久久久久久久av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品久久久久成人av| 久久精品夜色国产| 三上悠亚av全集在线观看| 美女中出高潮动态图| 欧美丝袜亚洲另类| 久久久久久伊人网av| 99热全是精品| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久国产欧美日韩av| 国产一区二区在线观看av| 交换朋友夫妻互换小说| 少妇人妻 视频| 在线观看三级黄色| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲国产日韩一区二区| 久久精品夜色国产| 中文字幕亚洲精品专区| 国产免费又黄又爽又色| 久久久精品免费免费高清| 国产精品99久久久久久久久| 国产av精品麻豆| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 在线观看三级黄色| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲精品456在线播放app| 黄色欧美视频在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 99热网站在线观看| 午夜激情久久久久久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 国内精品宾馆在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩成人伦理影院| 国产精品久久久久久久电影| 婷婷色麻豆天堂久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线观看国产h片| 亚洲国产最新在线播放| 狂野欧美激情性bbbbbb| 丝瓜视频免费看黄片| 免费少妇av软件| 亚洲,欧美,日韩| 高清午夜精品一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜久久久在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 黄色视频在线播放观看不卡| 久热久热在线精品观看| 在线观看人妻少妇| 黄色配什么色好看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 丰满乱子伦码专区| 亚洲欧美清纯卡通| 三级国产精品片| 久久狼人影院| videosex国产| 国产黄频视频在线观看| 成人国产av品久久久| 天天影视国产精品| 久久久久久久久久久免费av| 免费高清在线观看视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久ye,这里只有精品| 成年人午夜在线观看视频| 成年av动漫网址| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 搡女人真爽免费视频火全软件| 一级毛片电影观看| 日本欧美国产在线视频| 99久久人妻综合| 日韩成人伦理影院| 热re99久久国产66热| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 婷婷色av中文字幕| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品 国内视频| 国产精品人妻久久久影院| 日韩欧美精品免费久久| 国产精品久久久久久精品古装| 精品一品国产午夜福利视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 一区在线观看完整版| 黑人猛操日本美女一级片| 国内精品宾馆在线| 丁香六月天网| 久久久久国产网址| 2022亚洲国产成人精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品卡一卡二卡四卡免费| a级毛色黄片| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲久久久国产精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚州av有码| 在线观看免费高清a一片| 久久99热6这里只有精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 精品久久蜜臀av无| 99久久综合免费| 中文字幕制服av| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品无大码| 男女边吃奶边做爰视频| 免费观看的影片在线观看| av线在线观看网站| 亚洲在久久综合| 22中文网久久字幕| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 老司机影院成人| 国产高清三级在线| 女人久久www免费人成看片| 日本色播在线视频| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 丝袜喷水一区| 插逼视频在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜激情av网站| 精品视频人人做人人爽| 国产av精品麻豆| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品久久久久久av不卡| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美激情国产日韩精品一区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日韩强制内射视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本黄大片高清| 亚洲国产精品专区欧美| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 免费看av在线观看网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 我的老师免费观看完整版| 亚洲精品日韩av片在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲第一av免费看| 女性生殖器流出的白浆| 欧美日韩精品成人综合77777| 黄色怎么调成土黄色| 晚上一个人看的免费电影| videosex国产| 日韩不卡一区二区三区视频在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 日韩免费高清中文字幕av| 国产乱人偷精品视频| 亚洲经典国产精华液单| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国精品久久久久久国模美| 性色av一级| 国产精品人妻久久久久久| 这个男人来自地球电影免费观看 | 激情五月婷婷亚洲| 曰老女人黄片| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 赤兔流量卡办理| a级毛片在线看网站| 丰满乱子伦码专区| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久欧美国产精品| 一区二区三区精品91| 久久综合国产亚洲精品| 久久精品国产亚洲网站| 国产不卡av网站在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 人人澡人人妻人| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 91精品三级在线观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 伦理电影免费视频| 三级国产精品片| 黄色一级大片看看| 精品国产乱码久久久久久小说| 男男h啪啪无遮挡| av在线app专区| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲av福利一区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 秋霞伦理黄片| 伊人亚洲综合成人网| 中文字幕最新亚洲高清| 三级国产精品片| 国产在线视频一区二区| 26uuu在线亚洲综合色| 午夜福利视频精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久精品性色| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 老熟女久久久| 免费观看在线日韩| 多毛熟女@视频| 丝袜在线中文字幕| 亚洲成人av在线免费| 精品一区二区免费观看| 高清欧美精品videossex| 国产午夜精品一二区理论片| 免费观看a级毛片全部| 午夜老司机福利剧场| 欧美97在线视频| 国产黄频视频在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 91成人精品电影| 午夜日本视频在线| 高清不卡的av网站| 亚洲少妇的诱惑av| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本av手机在线免费观看| av黄色大香蕉| 母亲3免费完整高清在线观看 | 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 九九在线视频观看精品| 九色成人免费人妻av| 美女视频免费永久观看网站| 插逼视频在线观看| 多毛熟女@视频| 中文字幕免费在线视频6| 天天操日日干夜夜撸| 一级二级三级毛片免费看| 内地一区二区视频在线| 满18在线观看网站| 观看美女的网站| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品国产三级专区第一集| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产高清三级在线| 黄片无遮挡物在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲精品国产色婷婷电影| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 制服人妻中文乱码| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲av国产av综合av卡| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 成人手机av| 午夜福利视频精品| 美女中出高潮动态图| 看非洲黑人一级黄片| 午夜激情av网站| 亚洲人成77777在线视频| 搡老乐熟女国产| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲av国产av综合av卡| 久久韩国三级中文字幕| 美女中出高潮动态图| 少妇被粗大猛烈的视频| 99久国产av精品国产电影| 久久精品国产亚洲av涩爱| 大码成人一级视频| 超碰97精品在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 青青草视频在线视频观看| 免费黄频网站在线观看国产| 成人黄色视频免费在线看| 五月天丁香电影| 成人免费观看视频高清| 亚洲内射少妇av| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美三级亚洲精品| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 久久国产精品大桥未久av| 在线观看国产h片| 97在线人人人人妻| 日本与韩国留学比较| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美另类一区| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产成人91sexporn| 99热全是精品| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲欧洲日产国产| 18禁动态无遮挡网站| 国产免费福利视频在线观看| av国产精品久久久久影院| h视频一区二区三区| av免费观看日本| 欧美xxxx性猛交bbbb| www.av在线官网国产| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品一二三区在线看| 色5月婷婷丁香| 色婷婷av一区二区三区视频| 99热全是精品| av.在线天堂| 久久综合国产亚洲精品| 久久精品久久久久久久性| 国产精品一区二区在线观看99| 97超视频在线观看视频| 亚洲综合精品二区| 99久久精品一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 99热全是精品| 国产av码专区亚洲av| 欧美性感艳星| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲国产色片| 亚洲经典国产精华液单| 久久久久人妻精品一区果冻| 丝袜喷水一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产极品天堂在线| 99久国产av精品国产电影| 黄色一级大片看看| 日韩强制内射视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩伦理黄色片| 秋霞在线观看毛片| 大话2 男鬼变身卡| 丝袜美足系列| 国产在线视频一区二区| 一级毛片电影观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 看非洲黑人一级黄片| 午夜激情福利司机影院| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 观看美女的网站| 久久这里有精品视频免费| 亚洲国产av影院在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲精品自拍成人| 一本久久精品| 大香蕉久久网| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 免费人成在线观看视频色| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲成人一二三区av| 精品人妻偷拍中文字幕| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产色爽女视频免费观看| 又大又黄又爽视频免费| 妹子高潮喷水视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| a 毛片基地| 熟女电影av网| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产色爽女视频免费观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 美女视频免费永久观看网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久久久精品性色| 欧美三级亚洲精品| 能在线免费看毛片的网站| 国产免费现黄频在线看| av国产精品久久久久影院| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 一级爰片在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 老熟女久久久| 最新中文字幕久久久久| 国产精品蜜桃在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产一区二区三区综合在线观看 | 伦理电影免费视频| 秋霞伦理黄片| 亚洲av福利一区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 如何舔出高潮| 午夜av观看不卡| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| av国产久精品久网站免费入址| 国产成人精品在线电影| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美+日韩+精品| 9色porny在线观看| 国产成人一区二区在线| 国产精品女同一区二区软件| 蜜桃在线观看..| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 久久久午夜欧美精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产免费一级a男人的天堂| 精品一区二区三区视频在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| videossex国产| 九九在线视频观看精品| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲成人av在线免费| 成人无遮挡网站| 老司机影院毛片| 好男人视频免费观看在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲国产最新在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 插阴视频在线观看视频| 全区人妻精品视频| 国内精品宾馆在线| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲四区av| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品久久久久久精品电影小说| 满18在线观看网站| 热99国产精品久久久久久7| 大话2 男鬼变身卡| av女优亚洲男人天堂| 男的添女的下面高潮视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| av网站免费在线观看视频| 午夜激情福利司机影院| 母亲3免费完整高清在线观看 | 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 热re99久久精品国产66热6| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 亚洲av综合色区一区| 五月伊人婷婷丁香| 飞空精品影院首页| 欧美bdsm另类| 亚洲精品一区蜜桃| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 天天影视国产精品| 男女边吃奶边做爰视频| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 日韩人妻高清精品专区| 97精品久久久久久久久久精品| 国产黄色免费在线视频| 三级国产精品片| 欧美日韩视频精品一区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美亚洲日本最大视频资源| av福利片在线| 新久久久久国产一级毛片| 久久久久视频综合| 精品一区二区三卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲性久久影院| 免费观看无遮挡的男女| 夫妻性生交免费视频一级片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产男女超爽视频在线观看| 在现免费观看毛片| 国产精品 国内视频| 另类精品久久| 最新中文字幕久久久久| 伊人久久国产一区二区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 老熟女久久久| 欧美精品国产亚洲| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 人人妻人人澡人人看| 日日啪夜夜爽| 久久久国产一区二区|