葛根素對小鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用及機制研究

姜辰，楊浩鵬

缺血性腦血管病嚴重危害人類的生命安全健康，目前仍缺乏行之有效的治療手段[1]。近年來，腦缺血再灌注損傷的分子機制被廣泛研究，研究證實雌激素對于缺血性腦損傷有神經保護作用，流行病學上表現(xiàn)為中青年女性比同齡男性的卒中發(fā)生率更低[2-3]。在缺血再灌注損傷中，雌激素受體（estrogen receptor，ER）的表達異常與缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）相互作用，激活如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等炎性細胞因子，從而導致細胞的級聯(lián)性損傷[4-6]。有研究表明葛根素對局灶性腦缺血誘導的神經細胞損傷有一定保護作用，其在臨床中治療缺血性卒中的作用亦有文獻支持[7-8]。本研究采用線栓法建立小鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察葛根素對ER-α與HIF-1α的表達及下游炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的影響，探討葛根素對腦缺血再灌注損傷的神經保護潛在機制。

1 材料與方法

1.1 動物與實驗試劑 健康成年雌性C57BL小鼠180只，體重20～25 g，清潔級，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供。葛根素注射液由浙江康恩貝制藥股份有限公司提供，使用時根據劑量用注射用生理鹽水（中國大冢制藥有限公司）稀釋。2，3，5-三苯基四唑氮紅（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（上海靈錦精細化工有限公司）；總蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術研究所）；牛血清白蛋白（BSA，碧云天生物技術研究所）；特超敏化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（碧云天生物技術研究所）。實驗所用抗體均購買于Santa Cruz Biotechnology；所用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。

1.2 動物分組及給藥

1.2.1 葛根素對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用 取雌性C57BL小鼠60只，按體重大小編號后隨機分為假手術組、溶劑對照組、葛根素低劑量組（100 mg·kg-1）、中劑量組（250 mg·kg-1）和高劑量組（500 mg·kg-1），每組12只，神經功能評分后6只用于測定腦梗死體積，6只用于測定腦含水量。對溶劑對照組與葛根素高、中、低劑量組采用線栓法制備缺血2 h再灌注24 h局灶性腦缺血模型。葛根素各劑量組給藥體積均為0.01 ml·g-1，假手術組和溶劑對照組均給予等體積的生理鹽水，所有實驗組于手術前30 min腹腔預防性給藥。

1.2.2 腦缺血再灌注損傷后ER-α和HIF-1α動態(tài)表達的時程變化 取雌性C57BL小鼠60只，按體重大小編號后隨機分為假手術組、再灌注2 h組、再灌注6 h組、再灌注12 h組、再灌注24 h組，每組12只，其中6只無任何給藥，另6只于手術前30 min腹腔注射0.01 ml·g-1生理鹽水作為溶劑對照。對所有再灌注組均缺血2 h后方進行再灌注，從而建立不同再灌注時長的局灶性腦缺血再灌注模型。并在手術結束后取腦組織提取蛋白，測定ER-α和HIF-1α蛋白動態(tài)表達水平。

1.2.3 葛根素對腦缺血再灌注損傷后ER-α、HIF-1α表達及炎癥因子釋放的調節(jié)作用 取雌性C57BL小鼠60只，按體重大小編號后隨機分為假手術組、溶劑對照組、葛根素低劑量組（100 mg·kg-1）、中劑量組（250 mg·kg-1）和高劑量組（500 mg·kg-1），每組12只，其中6只用于測定ER-α、HIF-1α表達水平，6只用于測定炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放。對溶劑對照組與葛根素高、中、低劑量組采用線栓法制備缺血2 h再灌注12 h局灶性腦缺血模型。葛根素各劑量組給藥體積均為0.01 ml·g-1，假手術組和溶劑對照組均給予等體積的生理鹽水，所有實驗組于手術前30 min腹腔預防性給藥。

1.3 實驗方法

1.3.1 局灶性腦缺血再灌注模型的建立及神經功能評分 采用線栓法制備小鼠右側大腦中動脈缺血再灌注模型[9]。主要步驟為分離并暴露小鼠右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，由遠端頸外動脈插入制備好的線栓進入頸內動脈造成大腦中動脈閉塞從而缺血。2 h后拔除線栓實施再灌注。假手術組僅分離頸總動脈。

小鼠于缺血2 h再灌注24 h后進行神經功能評分，評分參考Longa評分法：0分：無神經功能缺損；1分：癱瘓側前爪不能完全伸展；2分：行走時向癱瘓側轉圈；3分：行走時向癱瘓側傾倒；4分：不能自發(fā)行走。

1.3.2 腦梗死體積與腦含水量的測定 小鼠于缺血2 h再灌注24 h后斷頭、取腦、冷凍后進行冠狀切片，將腦片置于2%的TTC溶液中，37℃避光孵育約30 min后取出觀察，正常腦組織染為紅色，腦梗死區(qū)不著色。染色腦片置于10%中性甲醛中固定，掃描拍照后應用圖像分析系統(tǒng)測量腦梗死面積。根據公式V=t×（A1+A2+…+An）算出梗死體積V。其中t為切片厚度，A為每個切片單側梗死面積，n為單個鼠腦的切片數(shù)。本實驗中t=2 mm，n=5。梗死體積百分比（%）=（梗死體積/對側半球體積）×100%。

小鼠于缺血2 h再灌注24 h后斷頭、取缺血側腦并稱出濕重。將腦組織放入105℃烤箱內烘干24 h后稱出干重。腦含水量=[（濕重-干重）/濕重]×100%。

1.3.3 蛋白質免疫印跡法檢測ER-α與HIF-1α表達 蛋白質免疫印跡法（Western blot）實驗步驟：取小鼠缺血側皮層組織0.1 g，按總蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，并采用Bradford法測定含量。按30 μg蛋白量上樣進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。濕法轉膜，200 mA恒流轉膜2 h。放入5% BSA-TBST封閉液中封閉1.5 h后分別加入一抗（兔抗小鼠ER-α抗體，1∶500；兔抗小鼠HIF-1α抗體，1∶800；兔抗小鼠β-actin抗體1∶2500），4℃搖床過夜。而后加入二抗（山羊抗兔，1∶5000）室溫下孵育1 h，兩次抗體孵育后均用TBST洗膜3次，每次10 min。最后進行顯色并用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測TNF-α、IL-1β和IL-6含量 按照ELISA試劑盒說明書進行操作，設標準孔8孔建立相應TNF-α、IL-1β和IL-6的標準曲線，取缺血側腦組織勻漿液離心后的上清液，以不同濃度稀釋后按加樣-甩干-孵育生物素標記抗體工作液-甩干-洗板-孵育辣根過氧化物酶標記親和素工作液-甩干-洗板-顯色-讀板的順序，于酶標儀450 nm波長處測各孔吸光度OD450，根據樣品OD450在相應標準曲線的位置計算出樣品中TNF-α、IL-1β和IL-6含量，并根據組織裂解液濃度計算出每克腦組織中所含細胞因子的微克數(shù)（μg·g-1）。

1.4 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)數(shù)據用表示。兩組間進行組間t檢驗；3組及3組以上采用單因素方差分析法，比較顯示有整體差異后，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。統(tǒng)計學分析結果P＜0.05認為有顯著性差異。

2 結果

2.1 葛根素對腦缺血再灌注損傷后梗死體積、神經功能評分以及腦含水量的影響 TTC染色顯示腦缺血梗死區(qū)域呈蒼白色，溶劑對照組缺血2 h再灌注24 h后，腦梗死體積較手術組增加，差異有統(tǒng)計學意義。與溶劑對照組相比，低劑量（P=0.005）、中劑量（P＜0.001）和高劑量（P＜0.001）葛根素組均可降低再灌注24 h后腦梗死體積，差異有統(tǒng)計學意義（圖1，表1）。

神經功能評分結果顯示：與溶劑對照組相比，葛根素可改善小鼠缺血2 h再灌注24 h后的神經功能評分，但僅高劑量組與溶劑對照組評分差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）（表1）。

干濕重法測得缺血2 h再灌注24 h后腦組織含水量結果顯示：假手術組腦含水量為（79.2±9.1）%，溶劑對照組缺血側腦含水量為（85.3±10.2）%，與中劑量（P＜0.001）、高劑量（P＜0.001）葛根素組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（表1）。

2.2 腦缺血再灌注損傷后ER-α和HIF-1α的表達與葛根素的調節(jié)作用 Western blot結果顯示，局灶性腦缺血2 h后，隨著再灌注時間的增加，相比于假手術組，手術組ER-α表達逐漸降低，HIF-1α表達逐漸升高，其中再灌注6 h、12 h、24 h三組差異具有統(tǒng)計學意義，均P＜0.001，缺血2 h再灌注12 h ER-α和HIF-1α表達變化相比假手術組最為顯著（圖2）。

葛根素各劑量組均可改善局灶性腦缺血2 h再灌注12 h所誘導的ER-α表達下調及HIF-1α表達上調，其中中劑量組（P＜0.001）、高劑量組（P＜0.001）的改善作用具有統(tǒng)計學意義（圖3）。

2.3 葛根素對腦缺血再灌注損傷后TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響 ELISA結果顯示，缺血2 h再灌注12 h后，與假手術組相比，溶劑對照組腦組織中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（表2）。葛根素各劑量組均可降低腦缺血再灌注損傷誘導的促炎細胞因子的表達，其中，中劑量組、高劑量組對TNF-α、IL-1β和IL-6均可顯著性下調（中劑量組vs溶劑對照組TNF-α：P＜0.001；高劑量vs溶劑對照組TNF-α：P＜0.001；中劑量組vs溶劑對照組IL-1β：P＜0.001；高劑量vs溶劑對照組IL-1β：P＜0.001；中劑量組vs溶劑對照組IL-6：P=0.046；高劑量vs溶劑對照組IL-6：P=0.004）。與溶劑對照組相比，低劑量組僅顯著性下調IL-1β（P=0.030）（表2）。

圖1 腦缺血再灌注損傷后梗死體積示意圖

表1 各組小鼠腦梗死體積、神經行為學評分及缺血側腦含水量的比較

3 討論

缺血性卒中發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高。研究中藥改善腦缺血再灌注損傷的作用機制，可為臨床上缺血性卒中造成的神經損傷防治提供新的策略，對有效預防和治療腦血管疾病、降低腦血管疾病的致死率具有重要意義。

葛根素作為豆科植物葛根中提取的一種黃酮苷，是葛根治療心腦血管疾病的物質基礎之一?，F(xiàn)代研究表明，通過雌激素樣作用，葛根素可降低去勢雌性大鼠腦梗死體積，保護腦缺血半暗帶神經元[10-11]。相關機制研究顯示，葛根素的神經保護作用主要體現(xiàn)為阻止局部炎癥誘發(fā)的級聯(lián)反應并抑制神經細胞凋亡，但其作用機制與雌激素樣作用的聯(lián)系尚未明確[12]。

圖2 腦缺血再灌注損傷后ER-α和HIF-1α的動態(tài)表達

圖3 葛根素對腦缺血再灌注損傷后ER-α和HIF-1α表達的影響

表2 各組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β以及IL-6的比較

2016年心臟病與卒中統(tǒng)計數(shù)據顯示，女性在青壯年時期（絕經前）的卒中發(fā)病率低于同齡男性，而在中老年時期（絕經后）的卒中發(fā)病率與死亡率均高于同齡男性，提示雌激素水平的變化影響女性卒中的發(fā)生發(fā)展[3]。有研究表明，雌激素本身即具有一定的神經保護機制，如抗炎作用、抗氧化作用、擴充腦血管并影響其自主功能調節(jié)作用[13]。除抗氧化作用以外，雌激素的神經保護機制大多通過與ER結合并進一步激活下游相關信號通路從而調節(jié)基因轉錄與蛋白活性，如雌激素可激活營養(yǎng)剝奪的PC12細胞的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，類雌激素他莫昔芬可激活海馬區(qū)神經元的抗凋亡通路[14]。

ER是經典的核受體，主要包括ER-α和ER-β，主要分布在細胞核，通過與雌激素或其類似物特異性結合后形成激素-受體復合物，調節(jié)生物體內特異性靶基因的轉錄。ER在中樞神經系統(tǒng)細胞如神經元、星型膠質細胞、小膠質細胞中廣泛存在，參與學習記憶、認知、運動等功能調節(jié)[15]。ER-α抑制劑已被報道可通過調節(jié)水通道蛋白4（aquaporins 4，AQP4）加重缺血再灌注后的腦損傷，同時ER-α缺陷型小鼠相比野生型小鼠在雌激素對腦缺血損傷的保護作用方面也被發(fā)現(xiàn)明顯減弱，顯示ER對腦缺血再灌注損傷中的保護作用[14]。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，ER的區(qū)域性表達下降與缺氧誘導的HIF-1α上調密切相關[16]。HIF-1α作為缺血、缺氧環(huán)境中的重要信號分子，對缺血缺氧環(huán)境中細胞的能量代謝、血管收縮控制、血管生成以及細胞凋亡等方面均具有重要的作用[17]。在改善炎癥方面，HIF-1α不僅可以調節(jié)參與炎癥反應的重要分子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、一氧化氮，同時在影響炎癥細胞因子的釋放以及調節(jié)免疫應答方面也發(fā)揮重要作用[18]。

眾所周知，炎癥因子的釋放在缺血性卒中后期的級聯(lián)損傷中尤為關鍵，因此，本研究從葛根素的雌激素樣作用出發(fā)，通過考察其對ER與HIF-1α的作用進一步延伸至對炎癥細胞因子釋放的影響，從而評價葛根素防治缺血性卒中的藥效并研究相關機制。實驗結果表明，葛根素可在腦缺血再灌注條件下同步激活ER并降低HIF-1α表達，抑制炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的釋放，改善神經炎癥。由此可以推測，葛根素對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用機制可能與調節(jié)ER和HIF-1α的表達及抑制下游炎癥因子的釋放有關。

本研究是基于小鼠缺血再灌注模型的基礎研究，僅探討了短期（24 h內）葛根素對ER、HIF-1及相關炎癥因子釋放的影響，因此具有一定的局限性。后期將針對葛根素對缺血性卒中更長期的影響進行研究和探索。

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