微波輔助提取絞股藍(lán)中黃酮的工藝研究

楊豆　張衛(wèi)波　樊華

摘要：為了合理利用絞股藍(lán)資源，對采摘末期絞股藍(lán)中的黃酮進(jìn)行微波輔助提取，選擇微波功率、微波溫度、微波時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為影響因子，在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗優(yōu)化了提取工藝，結(jié)果顯示，微波功率300W，微波時間10min，微波溫度70℃，料液比1：25g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%。此條件下黃酮的平均得率為4.898mg/g。采摘末期的絞股藍(lán)中富含植物黃酮?？蓪⑦@部分資源合理利用在飼料工業(yè)中來發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵字：微波輔助；提?。唤g股藍(lán)；黃酮；優(yōu)化

前言

絞股藍(lán)為葫蘆絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，又叫七葉草，因為生命力旺盛，容易栽培而俗稱遍地生根。絞股藍(lán)主要分布在陜西、四川、云南、湖南、湖北等地。秦巴山區(qū)盛產(chǎn)絞股藍(lán)，出口國外，因此被譽(yù)為“絞谷”。絞股藍(lán)具有很高的藥用價值。富含皂苷、氨基酸、微量元素、黃酮、萜類、有機(jī)酸、生物堿、多糖、蛋白質(zhì)等。其中的活性成分黃酮與動物的內(nèi)分泌、脂質(zhì)代謝及抗氧化有著密切的關(guān)系，在促進(jìn)動物生產(chǎn)性能及提高免疫力等方面起著重要作用。黃酮是植物的次級代謝產(chǎn)物，含量會隨植物生長發(fā)生變化，為了合理利用采摘末期的絞股藍(lán)資源，實(shí)驗采用微波輔助提取技術(shù)分別對4～11月份的絞股藍(lán)中的黃酮進(jìn)行提取并比較得率，重點(diǎn)對采摘末期11月份的絞股藍(lán)中的黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，以期為其在飼料工業(yè)中的合理應(yīng)用提供理論參考。

1實(shí)驗

1.1實(shí)驗材料及儀器

絞股藍(lán)購于陜西平利農(nóng)貿(mào)市場，清洗除雜后干燥粉碎，過60目篩于陰涼干燥處放置備用：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢驗所，純度≥99%）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

GR-200電子天平：日本AND；TU-1810紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；pHS-3TC（0.01級）精密酸度計：上海天達(dá)儀器有限公司：電熱鼓風(fēng)干燥箱101型：北京科偉永興儀器有限公司：DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司：WF-2000微波快速反應(yīng)系統(tǒng)：上海屹堯分析儀器有限公司：80-1型離心機(jī)：江蘇金壇正基儀器有限公司：FW117中草藥粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司。

1.2實(shí)驗

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確量取0.5g的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶解后轉(zhuǎn)入500mL的容量瓶中，配制1mg/mL的黃酮溶液，精密移取1mL放入100mL的容量瓶中用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇定容，配制10μg/mL的黃酮標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密移取0，1，2，3，4，5，6mL放入7個50mL的容量瓶中，各加入1.0mL濃度為50g/L的NaNO₂溶液混勻，放置6min后加入1.0mL濃度為100g/L的Al（NO₃）3溶液混勻，放置6min。再加入10.0mL濃度為40g/L的NaOH溶液，最后用30%乙醇定容至刻度，再放置15min后于510.00nm波長處測其吸光度，并以其為縱坐標(biāo)。黃酮待測液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.1206x-0.0208，R²=0.9972，說明黃酮濃度在0～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2絞股藍(lán)中黃酮的提取

將備用的絞股藍(lán)粉末和乙醇水溶液按照一定的料液比配制好后移入微波反應(yīng)系統(tǒng)，設(shè)定微波功率、微波時間、微波溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行微波提取。提取后所得的混合液經(jīng)過抽濾、離心得到上清液，按照1.2.1的方法測定吸光度。計算絞股藍(lán)中黃酮的得率。

1.2.3黃酮得率的計算

黃酮得率/（mg/g）=[（y+0.0208）v/0.1206]/m

式中：y—待測液吸光度；v—測定液的體積（mL）；m—每次提取時所用絞股藍(lán)質(zhì)量：

1.3正交實(shí)驗設(shè)計

選擇微波功率、微波時間、微波溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)五個因素為正交實(shí)驗的考察因子，以絞股藍(lán)中黃酮得率為指標(biāo)，采用五因素四水平的正交實(shí)驗設(shè)計優(yōu)化絞股藍(lán)中黃酮的提取，實(shí)驗安排見表1。

2實(shí)驗結(jié)果及討論

2.1不同月份絞股藍(lán)中黃酮的提取效果比較

采摘末期的絞股藍(lán)當(dāng)作茶葉去加工經(jīng)濟(jì)價值較低，為了合理利用采摘末期的絞股藍(lán)資源，實(shí)驗探究了不同月份的絞股藍(lán)中黃酮得率的變化，分別設(shè)定設(shè)定微波功率300W，料液比1：20g/mL，微波溫度60℃，微波時間8min，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%進(jìn)行微波提取，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著月份的變化，絞股藍(lán)中黃酮的微波提取得率也有很大差異，其中六月份的絞股藍(lán)中黃酮的得率最高。4～6月份大部分的絞股藍(lán)開始大量采摘，其中的黃酮含量也隨采摘月份增大。6月份的絞股藍(lán)中的黃酮含量最高。之后。絞股藍(lán)中黃酮含量逐漸減小。11月份屬于絞股藍(lán)的采摘末期，此時的絞股藍(lán)的經(jīng)濟(jì)價值遠(yuǎn)不及4～8月份，但是其中的活性成分黃酮含量是6月份的80%左右，含量相對豐富。植物黃酮具有多種生物活性，在食品、化妝品、醫(yī)藥、畜牧等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，因此合理開發(fā)利用這部分資源具有現(xiàn)實(shí)意義重大。

2.2單因素實(shí)驗結(jié)果與分析

2.2.1微波功率的選擇

實(shí)驗過程中設(shè)定料液比1：20g/mL，微波溫度60℃。微波時間8min。乙醇體積分?jǐn)?shù)30%?？疾煳⒉üβ史謩e為100W，200W，300W，400W，500W時對絞股藍(lán)中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

微波功率是微波能的直接體現(xiàn)，微波功率越大。微波能越大。微波能會使提取原料在短時間內(nèi)升溫繼而破壞其細(xì)胞壁，促進(jìn)黃酮的溶出及在提取劑中的擴(kuò)散。微波功率越大破壁效果越好，但是過大的微波功率雖然在提取初期有利于黃酮的溶出，但是隨著提取時間的延長。局部過熱現(xiàn)象會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率降低。由圖2可知，在100～300W微波功率范圍內(nèi)，黃酮得率先增大后減小，300W時對應(yīng)的得率最大，因此選擇300W為較佳微波功率。endprint

2.2.2微波時間的選擇

實(shí)驗過程中設(shè)定料液比1：20g/mL，微波功率300W。微波溫度60℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%?？疾煳⒉〞r間分別為4min，6min，8min，10min。12min時對絞股藍(lán)中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3示。

黃酮的浸出是一個傳質(zhì)過程，在4～10min范圍內(nèi)，絞股藍(lán)中黃酮得率隨微波時間的延長不斷增大，10min時對應(yīng)的得率最大，微波時間再延長得率減小。合適的微波時間能使絞股藍(lán)達(dá)到活化狀態(tài)。增強(qiáng)絞股藍(lán)顆粒分子內(nèi)部的有效碰撞，促進(jìn)黃酮的溶出。微波時間短，絞股藍(lán)中的黃酮的提取不完全。微波時間過長，一方面導(dǎo)致提取劑揮發(fā)。另一方面，提取到的黃酮在長時間的微波作用下，結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，得不償失，由圖3可知，微波10min較好。

2.2.3微波溫度的選擇

實(shí)驗過程中設(shè)定料液比1：20g/mL，微波功率300W，微波時間8min，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，考察微波溫度分別為50℃，60℃，70℃，80℃，90℃時對絞股藍(lán)中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖4示。

微波溫度是微波提取過程中的重要影響因素之一，是微波能轉(zhuǎn)化為熱能的體現(xiàn)，直接影響絞股藍(lán)中黃酮分子的熱運(yùn)動。由圖4可知，微波溫度在50～70℃范圍內(nèi)，隨著微波溫度的升高，黃酮得率增大，70℃時提取效果最好，過高的微波溫度則易造成局部熱量聚集，高溫容易破壞黃酮結(jié)構(gòu)，因此得率下降，綜上，選擇70℃為較佳微波溫度。

2.2.4乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

實(shí)驗過程中設(shè)定料液比1：20g/mL，微波功率300W，微波時間8min，微波溫度60℃，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%，30%，40%，50%，60%時對絞股藍(lán)中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖5示。

黃酮類化合物為多羥基酚類，極性比乙醇強(qiáng)而比水弱，在選用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對絞股藍(lán)中的黃酮進(jìn)行提取時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加。絞股藍(lán)中黃酮的得率不斷增大，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為40%時，得率最大。乙醇體積分?jǐn)?shù)大于40%后，黃酮的得率降低，這可能是因為高濃度的乙醇水溶液在提取黃酮過程中，絞股藍(lán)中的其他醇溶性物質(zhì)也溶出。與黃酮相互競爭，導(dǎo)致得率降低。因此選擇體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇作為提取劑較合適。

2.2.5料液比的選擇

實(shí)驗過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，微波功率300W。微波時間8min。微波溫度60℃，考察料液比分別為1：10g/mL，1：15g/mL，1：20g/mL，1：25g/mL，1：30g/mL時對絞股藍(lán)中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖6示。

料液比是提取過程中傳質(zhì)的主要影響因素，料液比小，傳質(zhì)速率小，因此黃酮得率低，料液比增大，絞股藍(lán)中的黃酮得率不斷增大，但是提取原料絞股藍(lán)中的黃酮的總量是不變的，當(dāng)料液比增大到一定程度后，黃酮的得率變化幅度會越來越小。正如圖6中所示，絞股藍(lán)中黃酮得率在1：10～1：30g/mL范圍內(nèi)隨著料液比的增大而增大，當(dāng)料液比大于1：25g/mL時得率變化幅度很小，兼顧得率和提取成本，選擇1：25g/mL為較佳料液比。

3正交實(shí)驗結(jié)果及分析

為了優(yōu)化微波輔助提取絞股藍(lán)中黃酮的工藝條件，以單因素實(shí)驗中的五個因素作為影響因子，黃酮得率為指標(biāo)，通過L16（45）正交實(shí)驗確定最佳提取工藝參數(shù)，按照表1實(shí)驗設(shè)計進(jìn)行實(shí)驗。實(shí)驗結(jié)果見表2。方差分析見表3。

微波提取絞股藍(lán)黃酮中，各因素對黃酮得率的影響順序通過表2中的極差R反應(yīng)出來，因素對應(yīng)的R值越大。說明影響越大。通過比較可知，各因素對絞股藍(lán)中黃酮得率的影響順序為：微波功率>料液比>微波溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波時間。正交實(shí)驗所得的最優(yōu)工藝為：A₃B₃C₃D₄E₂，即微波功率300W，微波時間10min，微波溫度70℃，料液比1：25g/mL。乙醇體積分?jǐn)?shù)30%。為了驗證正交實(shí)驗確定的工藝參數(shù)，根據(jù)條件進(jìn)行三次平行實(shí)驗，以黃酮得率為指標(biāo)，評價其優(yōu)越性，三次平行提取的黃酮得率為4.876mg/g、4.913mg/g、4.905mg/g，平均得率為4.898mg/g，高于正交和單因素實(shí)驗中的任何組合，因此確定其為最佳工藝條件。

從表3的方差分析結(jié)果可以看出，微波功率對提取效果影響最顯著，F(xiàn)值最大，其次為料液比、微波溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時間，這和正交極差分析的結(jié)果吻合。因此在絞股藍(lán)黃酮的提取過程中要嚴(yán)格控制微波功率，可以適當(dāng)?shù)臏p小對提取效果影響最小的微波時間，達(dá)到低耗高效的提取效果。

結(jié)論

（1）微波提取絞股藍(lán)具有提取時間短、效率高、節(jié)省提取劑、綠色環(huán)保等特點(diǎn)。微波提取絞股藍(lán)黃酮過程中，各因素對絞股藍(lán)中黃酮得率的影響順序為：微波功率>料液比>微波溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>微波時間。

（2）正交優(yōu)化所得的最佳提取工藝條件為：微波功率300W，微波時間10min，微波溫度70℃，料液比1：25g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%。此條件黃酮得率達(dá)4.898mg/g。采摘末期的絞股藍(lán)中黃酮含量豐富。作為綠色的植物黃酮資源。在飼料中進(jìn)行合理開發(fā)利用，會創(chuàng)造更多的經(jīng)濟(jì)價值。endprint